Производство лентивирус
Summary
Для того, чтобы лентивирусов, ДНК векторы трансфекции в человеческий 293 клеток. После сбора урожая и обогатительное супернатант, титра вируса определяется флуоресценции выражение потока цитометр.
Abstract
РНК-интерференция (RNAi) представляет собой систему генов в живых клетках. В RNAi, гены гомологичные последовательности на короткий вмешательства РНК (миРНК) заставляют молчать в посттранскрипционных государства. Короткие РНК шпилька, предшественники миРНК, могут быть выражены с помощью лентивирус, что позволяет RNAi в различные типы клеток. Лентивирусов, такие как вирус иммунодефицита человека, способны заражать обе деления и не делящихся клеток. Опишем процедуру, которая для упаковки лентивирусов. Упаковка относится к подготовке компетентных вирус из ДНК векторы. Лентивирусов производственных систем вектора основаны на "разбить" система, где естественный вирусный геном был разделен на отдельные вспомогательные плазмиды конструкций. Это расщепление различных вирусных элементов на четыре отдельных векторов уменьшает риск создания репликации вируса, способного придаточных рекомбинации лентивирусов генома. Здесь вектор, содержащий shRNA интересов и три вектора упаковки (р-VSVG, pRSV, pMDL) являются временно трансфекции в человеческий 293 клеток. После по меньшей мере 48-часовой инкубации вируса содержащих супернатант собирают и концентрируют. Наконец, титра вируса определяется репортера (флуоресцентные) выражение потока цитометр.
Protocol
Acknowledgements
Сандлер Астма фундаментальных исследований Центра (SABRE)
Сандлер фонда
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS | Invitrogen | |||
| FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG | Roche | |||
| Bleach | Clorox | |||
| 10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes | Falcon | 353003 | ||
| Multichannel pipette | Rainin | |||
| Filtered pipette tips | Rainin | |||
| 1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm) | Eppendorf | |||
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | |||
| Tissue culture incubator at 5% CO2 | Coulter | |||
| Beckman SW41T.I rotor | ||||
| Beckman ultracentrifuge | Beckman | |||
| Fluorescent microscope | Coulter | |||
| FACS Array | Beckman |
References
- Reiser, J. Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors.. Gene Therapy. , 72-7211 (2000).
- Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. . J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
