Produção lentivírus

Summary

Para fazer lentivírus, vetores de DNA são transfectadas em células humanas 293. Após a colheita e concentrando-se o sobrenadante, título de vírus é determinado pela expressão de fluorescência com um citômetro de fluxo.

Abstract

Interferência de RNA (RNAi) é um sistema de silenciamento de genes em células vivas. Em RNAi, genes homólogos em seqüência de curto RNAs de interferência (siRNA) são silenciadas no estado pós-transcricional. RNAs hairpin curto, precursores de siRNA, podem ser expressas utilizando lentivírus, permitindo a RNAi em uma variedade de tipos de células. Lentivírus, como o Vírus da Imunodeficiência Humana, são capazes de infectar tanto divisão e não divisão das células. Vamos descrever um procedimento que a lentivírus pacote. Embalagem refere-se à preparação de vírus competentes de vetores de DNA. Sistemas de produção Lentivirus vector são baseados em um 'split' do sistema, onde o genoma viral naturais foi dividida em construções auxiliares individuais plasmídeo. Essa divisão dos diferentes elementos viral em quatro vetores separados diminui o risco de criar um vírus de replicação com capacidade de recombinação do genoma acidental lentiviral. Aqui, um vetor contendo os shRNA de interesse e de três vetores de embalagem (p-VSVG, PRSV, pMDL) são transitoriamente transfectadas em células humanas 293. Depois de pelo menos um período de incubação de 48 horas, o sobrenadante contendo o vírus é colhido e concentrada. Finalmente, título de vírus é determinado pelo repórter (fluorescente) expressão com um citômetro de fluxo.

Protocol

Parte 1: Transfecção de HEK 293 células para produzir Lentivirus * 24 horas antes de transfecção, placa de 2,5 X 10 6 células em um prato de 10 centímetros de uma confluência de 50-70% no dia seguinte. Iniciar este protocolo, preparando o DNA com o qual se vai depois de uma transfecção as células para fazer vírus. Primeiro, diluir FuGENE 6 Transfection reagente Roche, um reagente de lipídios que fazem as células ocupam DNA. Em um tubo de 1,5 ml, pipetar 30…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS		Invitrogen
FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG		Roche
Bleach		Clorox
10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes		Falcon	353003
Multichannel pipette		Rainin
Filtered pipette tips		Rainin
1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm)		Eppendorf
Ultracentrifuge tubes		Beckman
Tissue culture incubator at 5% CO2		Coulter
Beckman SW41T.I rotor
Beckman ultracentrifuge		Beckman
Fluorescent microscope		Coulter
FACS Array		Beckman