Summary
現在、フルオレセイン血管造影(FA)は、脈絡膜新生血管(CNV)の動物モデルにおける漏出パターンを特定するための好ましい方法です。ただし、FAは血管の形態に関する情報を提供しません。このプロトコルはマウス モデルでレーザー誘導されたCNVの異なった損害のタイプを特徴付けるのにインドシアニンの緑色の血管造影(ICGA)の使用を概説する。
Abstract
加齢黄斑変性症(AMD)は、高齢者の失明の主な原因であり、人口の高齢化により有病率が急速に増加しています。脈絡膜新生血管(CNV)または滲出型AMDは、すべてのAMD症例の10%〜20%を占め、AMD関連の失明の驚くべき80%〜90%の原因となっています。現在の抗VEGF療法は、患者の約50%で最適でない反応を示しています。CNV患者における抗VEGF治療に対する耐性は、しばしば細動脈CNVと関連しているが、レスポンダーは毛細血管CNVを有する傾向がある。フルオレセイン血管造影(FA)は、滲出型AMD患者および動物モデルの漏出パターンを評価するために一般的に使用されますが、CNV血管形態(細動脈CNV と毛細血管CNV)に関する情報は提供しません。このプロトコルはレーザー誘導されたCNVマウス モデルの病変のタイプを特徴付けるのにindocyanineの緑色の血管造影(ICGA)の使用をもたらす。この方法は、滲出型AMDにおける抗VEGF耐性のメカニズムと治療戦略を調査するために重要です。機構的および治療的研究におけるCNVの漏出と血管の特徴の両方を包括的に評価するために、FAと一緒にICGAを組み込むことが推奨されます。
Introduction
加齢黄斑変性症(AMD)は、高齢者の重度の視力低下につながる一般的な状態です1。米国だけでも、AMD患者数は現在の1,100万人から2050年には2,200万人近くに達すると予測されています。世界全体では、AMDの推定症例数は2040年までに2億8,800万人に達すると予想されています2。
脈絡膜新生血管(CNV)は、「滲出型」または血管新生AMDとも呼ばれ、網膜中心の下に異常な血管が形成されるため、視力に壊滅的な影響を与える可能性があります。これは、出血、網膜の滲出、および重大な視力喪失につながります。細胞外VEGFを標的とする抗血管内皮増殖因子(VEGF)療法の導入は、CNV治療に革命をもたらしました。しかし、これらの進歩にもかかわらず、患者の最大50%がこれらの治療法に対して最適ではない反応を示し、体液の蓄積や未解決の出血または新しい出血などの進行中の疾患活動性を示します3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14。
臨床試験では、CNV患者の抗VEGF耐性は、大口径の分岐細動脈、血管ループ、および吻合部接続を特徴とする細動脈CNVの存在に対応することが多いことが示されています9。抗VEGF治療を繰り返すと、血管の異常、動脈CNVの発症、そして最終的には抗VEGF療法に対する耐性に寄与する可能性があります14,15。細動脈CNVの場合、持続的な体液漏れは、特に血流の多い条件下で、動静脈吻合ループのタイトジャンクションが不適切に形成されることによって引き起こされる滲出の増加が原因である可能性があります9。逆に、抗VEGF治療によく反応する個人は、毛細血管CNVを示す傾向があります。
動物モデルを用いた研究では、高齢マウスのレーザー誘導CNVが細動脈CNVを発症し、抗VEGF治療に対する耐性を示すことを実証しました16,17。逆に、若いマウスにおけるレーザー誘導CNVは、毛細血管CNVの発達と抗VEGF治療に対する高い反応性につながります。したがって、機構的研究と治療的研究の両方において、CNV血管タイプを区別することが重要です。
臨床現場では、CNVは一般的にフルオレセイン血管造影(FA)の漏出パターン(例、タイプ1、タイプ2)に基づいて分類され、フルオレセイン色素を使用して滲出を追跡し、病的漏出の領域を特定します。AMDの研究では、CNVは主に動物モデルでFAを使用して研究されています。しかし、FAはCNVの血管形態を明らかにすることができません。さらに、FAは可視光スペクトルの画像のみをキャプチャし、網膜色素上皮(RPE)の下の脈絡膜血管系を視覚化することはできません。対照的に、血漿タンパク質に強い親和性を示すインドシアニングリーン(ICG)は、優勢な血管内保持を促進し、血管構造と血流の可視化を可能にします9。ICGの近赤外蛍光特性を利用することで、ICG血管造影法(ICGA)を用いて網膜および脈絡膜色素を画像化することが可能になります。これに関連して、FAとICGAを組み合わせて、毛細血管と細動脈CNVが観察される若齢および老齢マウスにおけるレーザー誘発脈絡膜新生血管(CNV)の漏出と血管形態を調査するプロトコルが提示されます。
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Protocol
この研究で実施された動物実験は、ベイラー医科大学の動物実験委員会(IACUC)から承認されました。すべての手順は、Association for Research in Vision and Ophthalmology(ARVO)の眼科および視力研究における動物の使用に関する声明に概説されているガイドラインに準拠して実施されました。本研究では、若齢(7〜9週間)および老齢(12〜16か月)のC57BL / 6J雄および雌マウスを使用しました。動物は市販の供給源から入手した( 資料表参照)。
1. イメージングシステムの準備
- イメージングプラットフォーム( 材料表を参照)に加熱パッドを配置して、イメージング中にマウスの体温が維持されるようにします。加熱パッドを作動させ、温度を35°Cに調整します。
- ダストカバーを取り外し、レーザー走査型検眼鏡の電源を入れます。マシンに55°レンズを置きます。
- イメージングソフトウェア( 材料表を参照)をセットアップし、遺伝子型、性別、年齢などの重要な情報を入力します。イメージングセッションが開始されたら、ICGA画像をキャプチャするための IR (赤外線チャネル)を選択します。
2. ICGAおよびFA前の動物調製
- マウスの重量を量って、必要な麻酔の量(ケタミン/キシラジン70-100 / 2.5-10 mg / kg、 材料表を参照)を決定します。
注:代謝プロファイルはマウス株によって異なるため、投与量の最適化は非常に重要です。.イメージングを完了する前にマウスが目を覚ますこと、または過剰摂取や動物の死亡の可能性のリスクを避けるために、適切な投与量を決定することが不可欠です。 - 1 mLの滅菌シリンジと30〜32 Gの針を使用して、腹腔内注射で麻酔を送達します。.マウスの片方の足をそっとつまんで、マウスに適切に麻酔がかけられているかどうかを確認します。動物が何らかの反応や動きを示した場合は、次のステップに進む前に、さらに時間待つことをお勧めします。これにより、動物は落ち着き、その後の処置に最適な条件を確保します。
- 1%トロピカミド点眼液を投与して、マウスの両眼を拡張します。眼球運動およびまばたきを減らすために両目で0.5%のプロパラカインの塩酸塩の低下( 材料のテーブルを見なさい)を使用する前に少なくとも30秒待ちなさい。これに続いて、潤滑剤のアイジェルドロップで。
注:麻酔の全期間を通じて、角膜混濁につながる可能性のあるマウスの目の極度の乾燥の問題に対処することが重要です。この不透明度により、視界が妨げられるため、その後のイメージングが困難になります。これを防ぐには、潤滑剤の点眼薬を継続的に塗布して、マウスの目の潤いを保つことが重要です。 - マウスを温水パッドの上に置きます。
注:マウスは表面積と体積の比率が高いため、環境への熱損失が増加します。麻酔による体温低下と組み合わさると、マウスに重大なリスクをもたらし、低体温症による死亡につながる可能性があります。低体温症を予防し、処置中のマウスの健康を確保するために必要な予防策を講じることが重要です。 - 2 mg/mL ICG と 20 mg/mL フルオレセイン色素の 1:1 容量の混合物を調製します( 材料表を参照)。1 mLのシリンジと32 Gの針を使用して腹腔内注射により、250 μLの混合物を投与します。.
- 臓器に穴が開かないように、マウスの腹部の左下、後ろ足の近くの後脚に針を挿入します。
- プランジャーを慎重に引き出し、シリンジキャップに血液が入っていないことを確認します。一定のペースを維持しながら、ゆっくりと着実に染料を注入していきます。
注:ICG色素は、使用前に0.22 μmシリンジフィルターでろ過する必要があります。
3. ICGAとFA
- イメージングプラットフォームの加熱パッドにマウスを置き、イメージングを開始します。
- マウスの本体をカメラに対して 45 度の角度で配置し、頭を少し下に回転させます。これにより、視神経をカメラの焦点の中心に置くことができます。
- 綿棒を使用して、目を丁寧に拭き、最初に画像化されている目の潤滑剤の点眼薬またはジェルの層を取り除きます。イメージング手順の完了後、すぐに潤滑剤ゲルドロップを塗布してください。
注意: 麻酔中に1分以上潤滑せずに目を放置することはお勧めしません。 - カメラをマウスの目に向かって動かします。アクイジションモジュールから FAチャンネル を選択します。FAチャネルから放出される発光は、マウス角膜の中心に配置するために使用され、より迅速な配置が可能です。
- 視神経が画面の中心になるようにマウスの頭を配置し、レーザー走査型検眼鏡を斜めに傾ける必要がないようにします。マウスの頭の位置を少し調整して、目的の位置合わせを実現します。
- アクイジションモジュールで、 ICGAチャンネルを選択します。レーザー強度が100%に設定されていることを確認し、適切なレンズに合わせて55°オプションを選択します。これにより、レーザー走査型検眼鏡の最適な設定が保証されます。
注意: 過飽和を防ぐために、初期段階をイメージングする場合は、通常約25%〜50%の低いレーザー強度を使用する必要があります。この範囲でレーザー強度を調整すると、過飽和を引き起こすことなく、鮮明で正確な画像をキャプチャできます。 - イメージングソフトウェアで目が画面全体を占めている場合は、感度とフォーカスの設定を調整して、CNVメンブレンの最も鮮明な画像を取得します。
- 取得モジュールの 丸い黒い ボタンを回して、画像の感度を調整します。
- 検眼鏡の つまみ を回してピントを調整します。FAを用いて網膜血管系を可視化するための最適な焦点は、典型的には35〜45D(ジオプター)の範囲内である。一方、ICGAを使用して脈絡膜を視覚化するための理想的な焦点は、一般的に10〜15Dの間です。
注:CNVメンブレンのサイズが異なるため、血管形態の最適なイメージングを得るには、10〜30Dで焦点を調整する必要がある場合があります。
- ピントと感度を調整して最適な画像が得られたら、画像取得モジュールの 丸い黒い ボタンを押して画像を正規化します。ノーマライゼーションが完了したら(すべてのフレームがキャプチャされたら)、タッチスクリーンパネルの 取得 ボタンをクリックして画像を保存します。CNVをさまざまな角度から撮影するには、カメラを動かす必要がある場合があります。また、マウスをさまざまな位置に向けることで、CNV病変の最良の画像を提供することができます。
注:視神経から血管系を見るときは、レーザー走査型検眼鏡の焦点または位置を再調整する必要がある場合があります。 - アクイジションモジュールを使用して FAチャンネル に切り替えます。手順3.6〜3.7に記載されているのと同じ手順を実行して、各画像の感度と焦点を調整し、CNV病変の漏れをキャプチャします。
注意: CNV漏れの過飽和を回避し、漏れ領域を人為的に増やすために、正しい感度が選択されていることを確認してください。 - 注入後3〜4分後のICGAおよびFAの「初期段階」を画像化します。
注:「初期段階」とは、脈絡膜血管系がはっきりとはっきりと見える時期です。通常4〜8分の間に発生する中期では、網膜血管と脈絡膜血管ははるかに色あせて拡散します。後期(>8〜10分)が始まると、脈絡膜血管と網膜血管の両方が識別できなくなります。しかしながら、蛍光高CNV病変は、減少したバックグラウンドに対して最大のコントラストを示す。これらのタイミングは可変であり、注入するICG色素の濃度と量によって異なります。ICG色素の量が多いほど、各フェーズのタイムラインが長くなり、より明確な血管が得られる傾向があります。フェーズは、絶対的な時間ではなく、上記の主要な機能に基づいて定義する必要があります。 - すべての画像を取得したら、ゲル潤滑剤または軟膏をマウスの目に塗布し、回復のために加熱パッド上でマウスを注意深く監視します。通常、マウスが完全に回復するまでに1.5時間かかります。
- マウスが麻酔から完全に回復し、目覚めたら、マウスをケージと指定された保持エリアに戻します。
- イメージングシステムとレーザーをシャットダウンする前に、画像をTIFFまたはJPEGファイルとしてエクスポートして、後で分析します。
4. RPE/脈絡膜フラットマウントと染色
- 4%パラホルムアルデヒドで一晩目を固定します。PBSで目を3回洗います。水晶体と角膜を取り除きます。
- ブロッキング溶液(10%ウシ血清アルブミン、0.6%Triton X-100 in PBS)中で室温で1時間インキュベートします。PBS洗浄を3回繰り返します。
- イソレクチンGS-IB4、Alexa-flour 568コンジュゲート、抗α平滑筋アクチン抗体( 材料表参照)をブロッキング溶液中で一晩インキュベートします。
- PBSで3回洗います。サンプルをAlexa Fluor 488ヤギ抗ウサギ二次抗体( 材料表参照)とともに室温で2時間インキュベートします。
- エッジから赤道まで放射状に 4 回カットします。網膜17を慎重に取り外します。
注意: 血管新生膜が誤って剥がれないように注意する必要があります。 - フラットマウントコロイドをスライドガラスに取り付けます。共焦点顕微鏡を使用してCNVを可視化します。
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Representative Results
プロトコルに続いて、ICGAおよびFAは、若齢(7〜9週間)および老齢(12〜16か月)のC57BL / 6Jマウスのレーザー誘導CNVで実施されました。FAはCNV病変の位置と漏出に関する情報を提供し(図1、左パネル)、ICGAはCNV病変の血管形態を明らかにします(図1、右パネル)。若いマウスでは、毛細血管CNVがCNV病変を支配しています。対照的に、年老いたマウスは、大口径の血管、血管ループ、および吻合部接続を特徴とする細動脈CNVを示します。若齢マウスも老齢マウスも、FAの網膜血管系がはっきりと見える(図1、左パネル)。若いマウスのICGA画像では、網膜血管系が見えず、脈絡膜血管が薄く見え、脈絡膜血管系に焦点を当てたICGAの中期を示しています。高齢マウスのICGA画像では、脈絡膜血管が薄色した状態で部分的な網膜血管系が観察され、老齢マウスでは細動脈CNVのサイズが大きいため、網膜と脈絡膜の間の焦点を持つ中期が示唆されます。高齢マウスの動脈CNVは、若いマウスの毛細血管CNVと比較して、CNVサイズが大きく(図2)、有意に多くの漏出を示します。抗平滑筋アクチン抗体による免疫染色は、高齢マウスのCNV血管系を広範囲に標識し、細動脈の形態を確認します(図3)。対照的に、α平滑筋アクチンによる最小限の染色は、毛細血管の形態と一致する若いマウスの病変部位の血管系で観察されます。
図1:若齢マウスと老齢マウスのレーザー誘導CNVを描写したFA画像とICGA画像の比較。 FA画像はCNV病変の漏出を示し、ICGAは血管形態の視覚化を提供します。スケールバー:200 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:ICGA画像に基づく若齢マウスと老齢マウスのCNV病変サイズの定量化。 CNV領域を測定し、若齢マウスと老齢マウスでそれぞれ合計26および14のレーザースポットを解析した。エラーバーは標準偏差±平均を表します。 統計解析は対応のない t検定を用いて行いました。P < 0.0001 です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:RPE/脈絡膜フラットマウント上のAlexa 568イソレクチンおよび抗α平滑筋アクチン抗体と共標識した、若齢および老齢マウスのCNV病変の代表的な画像。 赤色はAlexa 568イソレクチン、緑色は平滑筋アクチン(SMA)αを表しています。スケールバー:100 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この研究では、インドシアニングリーン血管造影(ICGA)を使用して、レーザー誘導CNVを使用したマウスモデルにおける細動脈および毛細血管脈絡膜新生血管(CNV)の血管形態を特定することが実証されました。インドシアニングリーン(ICG)色素のヘモグロビン結合および赤外光特性により、研究コミュニティで現在採用されているフルオレセイン血管造影(FA)では困難なCNV形態の検出が可能になりました。
プロトコルの最初の重要なステップは、染料が臓器を貫通することなく腹腔内に注入されるようにすることです。針全体の挿入を避けながら、皮膚と面取りの間の角度を小さくして、左下の象限に適切に注入することで、インドシアニン色素の取り込みを改善することができます。染料を臓器に注入すると、取り込みが遅くなり、腹部臓器の裂傷、内出血、感染症などの合併症を引き起こす可能性があります。この手術のもう一つの重要な側面は、眼球の直径全体を見るために画像を取得する前に視神経を中心に置くことです。これには、FAチャンネルとマウスの目から発せられる発光を重ねながら、コンピュータ画面上の画像に注意を払いながら行う必要があります。縦方向の角度を固定するには、マシンを上下に調整するのではなく、マウスヘッドを直接所定の位置に傾けて、全視野を確実にキャプチャするのが最善です。
以前の研究では、ケタミン/キシラジン麻酔薬の使用が角膜混濁を引き起こす可能性があることが示されています18,19。これは、キシラジン20の量を減らすことによって最小限に抑えることができる。さらに、白内障の形成を防ぐために、角膜の水分を一定に保つことが重要です。これは、潤滑性の点眼薬またはジェルを使用して実現できます。これらの要因は、持続的な角膜損傷がICGA画像の鮮明さに影響を与えるため、イメージング頻度の増加と動物モデルの老化に特に重要になります。長時間のイメージングの場合、白内障の形成を防ぐために、ゲルベースの緩衝液の上にポリメチルメタクリレートコンタクトレンズを採用することによって手順を変更することができる21。
注入方法も重要な要素です。この研究は腹腔内 (IP) 注射に焦点を当てていますが、静脈内 (IV) 注射、特に尾静脈注射を使用して、手順を少し変更して手順を実行できます。腹腔内注射は、特に色素沈着マウスでの達成の容易さと、処置中の信頼性のために選択されました。CNVの定量実験では、多数のマウスを効率的に処理する必要があるため、これは重要な考慮事項です。注射方法に関係なく、CNVの血管造影の特徴は、動物モデルでさまざまなタイプの脈絡膜病変を特徴付けるときに、そのサイズが大きく、脈絡膜と網膜の間の位置にあるため、引き続き取得できます。しかし、これは、主に脈絡膜の内部に位置し、正確な診断のためにIV-ICGA経時的イメージングを必要とする滲出型AMDの別のサブタイプであるポリプイド脈絡膜血管症(PCV)では異なる22。
FA/ICGAの組み合わせの限界の1つは、CNV滲出のさまざまな段階を捕捉する際のばらつきが大きくなることです。理想的なICGA画像とFA画像では、初期段階と後期段階の最適なタイミングが必ずしも一致するとは限らず、各眼の2つのモード間で焦点を調整するためにさらに時間が必要です。この態様は、3相のタイミングにより多くの変動性をもたらし、尾静脈注入22と比較してより長いイメージング時間を必要とするIP注入手順によって拡大される。しかし、これらの要因がCNV血管形態の検出に及ぼす影響は最小限であり、FA/ICGAの組み合わせの利点はこれらの制限を上回ります。
最近の研究では、毛細血管や細動脈CNVなどのさまざまなタイプのCNV病変が、現在の抗VEGF療法に対して異なる反応を示すことが示されています9,16,17。したがって、CNV病変の血管形態を決定することは非常に重要です。しかし、現在選択されているFAは、この重要な情報を提供していません。研究コミュニティでは、血管新生AMDモデルのイメージングにICGAを使用することが推奨されています。この研究は、ICGAとFAを併用して、CNVの漏出と血管の特徴の両方を評価して、メカニズムと治療の研究に便利に実行できることを実証しました。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
この研究は、BrightFocus Foundation、Retina Research Foundation、Mullen Foundation、Sarah Campbell Blaffer Endowment in OphthalmologyからYFへの助成金、Baylor College of MedicineへのNIHコア助成金2P30EY002520、およびBaylor College of Medicineの眼科へのResearch to Prevent Blindnessからの無制限の助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32-G Insulin Syringe | MHC Medical Products | NDC 08496-3015-01 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | |
| Anti-α smooth muscle Actin antibody | Abcam | ab5694 | |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-2323 | |
| C57BL/6J mice (7-9 weeks) | The Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Fluorescein Sodium Salt | Sigma-Aldrich | MFCD00167039 | |
| Gaymar T Pump Heat Therapy System | Gaymar | TP-500 | Water circulation heat pump for mouse recovery after imaging |
| GenTeal Gel | Genteal | NDC 58768-791-15 | Clear lubricant eye gel |
| GS-IB4 Alexa-Flour 568 conjugate | Invitrogen | I21412 | |
| Heidelberg Eye Explorerer | Heidelberg Engineering, Germany | HEYEX2 | |
| Indocyanine Green | Pfaultz & Bauer | I01250 | |
| Ketamine | Vedco Inc. | NDC 50989-996-06 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 416785000 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Sandoz | NDC 61314-016-01 | |
| Spectralis Multi-Modality Imaging System | Heidelberg Engineering, Germany | SPECTRALIS HRA+OCT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Tropicamide ophthalmic solution (1%) | Bausch & Lomb | NDC 24208-585-64 | For dilation of pupils |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | NADA 139-236 |
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