Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

אפיון מורפולוגיה וסקולרית של ניוון מקולרי נאו-וסקולרי הקשור לגיל על ידי אינדוציאנין אנגיוגרפיה ירוקה

Published: August 11, 2023 doi: 10.3791/65682
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Cullen Eye Institute, Baylor College of Medicine

Summary

נכון לעכשיו, אנגיוגרפיה פלואורסצאין (FA) היא השיטה המועדפת לזיהוי דפוסי דליפה במודלים של בעלי חיים של ניאו-וסקולריזציה כורואידית (CNV). עם זאת, FA אינו מספק מידע על מורפולוגיה של כלי הדם. פרוטוקול זה מתאר את השימוש באנגיוגרפיה ירוקה אינדוציאנינית (ICGA) כדי לאפיין סוגים שונים של נגעים של CNV המושרה בלייזר במודלים של עכברים.

Abstract

ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD) הוא גורם מוביל לעיוורון בקרב אנשים מבוגרים, ושכיחותו עולה במהירות עקב הזדקנות האוכלוסייה. ניאו-וסקולריזציה כורואידית (CNV) או AMD רטוב, המהווה 10%-20% מכלל מקרי AMD, אחראית ל-80%-90% מדאיגים של עיוורון הקשור ל-AMD. הטיפולים הנוכחיים נגד VEGF מראים תגובות תת-אופטימליות בכ-50% מהמטופלים. עמידות לטיפול נגד VEGF בחולי CNV קשורה לעיתים קרובות ל- CNV עורקי, בעוד שהמגיבים נוטים להיות CNV נימי. בעוד אנגיוגרפיה פלואורסצאין (FA) משמשת בדרך כלל להערכת דפוסי דליפה בחולי AMD רטובים ובמודלים של בעלי חיים, היא אינה מספקת מידע על מורפולוגיה וסקולרית של CNV (CNV עורקי לעומת CNV נימי). פרוטוקול זה מציג את השימוש באנגיוגרפיה ירוקה אינדוציאנינית (ICGA) כדי לאפיין סוגי נגעים במודלים של עכברי CNV המושרים בלייזר. שיטה זו חיונית לחקר המנגנונים ואסטרטגיות הטיפול בעמידות נגד VEGF ב- AMD רטוב. מומלץ לשלב ICGA לצד FA להערכה מקיפה של דליפה ותכונות כלי דם של CNV במחקרים מכניסטיים וטיפוליים.

Introduction

ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD) הוא מצב שכיח המוביל לאובדן ראייה חמור אצל אנשים מבוגרים1. בארצות הברית לבדה, מספר חולי AMD צפוי להכפיל את עצמו, ולהגיע לכמעט 22 מיליון עד 2050, לעומת 11 מיליון כיום. ברחבי העולם, המספר המשוער של מקרי AMD צפוי להגיע ל -288 מיליון מדהים עד 20402.

Choroidal neovascularization (CNV), הידוע גם בשם AMD "רטוב" או neovascular, יכול להיות השפעות הרסניות על הראייה עקב היווצרות של כלי דם חריגים מתחת הרשתית המרכזית. זה מוביל לדימום, הפרשה ברשתית ואובדן ראייה משמעותי. הכנסת טיפולים אנטי-וסקולריים בגורם גדילה אנדותל (VEGF), המכוונים ל-VEGF חוץ-תאי, חוללה מהפכה בטיפול ב-CNV. עם זאת, למרות התקדמות זו, עד 50% מהחולים מפגינים תגובות תת-אופטימליות לטיפולים אלה, עם פעילות מחלה מתמשכת כגון הצטברות נוזלים ודימומים לא פתורים או חדשים 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14.

מחקרים קליניים הצביעו על כך שעמידות נגד VEGF בחולי CNV תואמת לעתים קרובות לנוכחות של CNV עורקי, המאופיינת בעורקים מסתעפים בקליבר גדול, לולאות כלי דם וקשרים אנסטומטיים9. טיפול חוזר נגד VEGF יכול לתרום לנורמליזציה של כלי הדם, להתפתחות CNV עורקי, ובסופו של דבר, עמידות לטיפולים נגד VEGF14,15. במקרים של CNV עורקי, דליפת נוזלים מתמשכת נובעת ככל הנראה מהפרשה מוגברת הנגרמת על ידי צמתים הדוקים שלא נוצרו כראוי בלולאות אנסטומוטיות עורקיות, במיוחד בתנאים של זרימת דם גבוהה9. לעומת זאת, אנשים שמגיבים היטב לטיפול נגד VEGF נוטים להציג CNV נימי.

במחקרים שלנו המשתמשים במודלים של בעלי חיים, הראינו כי CNV המושרה בלייזר בעכברים מבוגרים מפתח CNV עורקי ומראה עמידות לטיפול נגד VEGF16,17. לעומת זאת, CNV המושרה בלייזר בעכברים צעירים מוביל להתפתחות של CNV נימי והיענות גבוהה לטיפול נגד VEGF. לכן, חיוני להבדיל בין סוגי כלי דם CNV הן לחקירות מכניסטיות והן טיפוליות.

במסגרות קליניות, CNV מסווג בדרך כלל בהתבסס על דפוסי דליפת אנגיוגרפיה פלואורסצאין (FA) (למשל, סוג 1, סוג 2), המשתמשים בצבע פלואורסצאין כדי לעקוב אחר הפרשה ולזהות אזורים של דליפה פתולוגית. במחקר AMD, CNV נחקר בעיקר באמצעות FA במודלים של בעלי חיים. עם זאת, FA אינו חושף את המורפולוגיה של כלי הדם של CNV. יתר על כן, FA לוכד רק תמונות בספקטרום האור הנראה ואינו יכול לדמיין את כלי הדם הכורואידיים מתחת לאפיתל פיגמנט הרשתית (RPE). לעומת זאת, אינדוציאנין ירוק (ICG), המציג זיקה חזקה לחלבוני פלזמה, מאפשר שימור תוך כלי דם דומיננטי ומאפשר הדמיה של מבנה כלי הדם וזרימת הדם9. על ידי ניצול התכונה הפלואורסצנטית התת-אדומה הקרובה של ICG, ניתן לצלם את הפיגמנט הרשתית והכורואידי באמצעות אנגיוגרפיה של ICG (ICGA). בהקשר זה, מוצג פרוטוקול המשלב FA ו- ICGA כדי לחקור את הדליפה ואת המורפולוגיה של כלי הדם של ניאו-וסקולריזציה כורואידית הנגרמת על ידי לייזר (CNV) בעכברים צעירים ומבוגרים, שם נצפה CNV נימי ועורקי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הניסויים בבעלי חיים שנערכו במחקר זה קיבלו אישור מהוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במכללת ביילור לרפואה. כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות המפורטות בהצהרת האגודה לחקר הראייה והעיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים בחקר העיניים והראייה. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברים זכרים ונקבות C57BL/6J צעירים (7-9 שבועות) וזקנים (12-16 חודשים). בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).

1. הכנת מערכת ההדמיה

  1. מקם כרית חימום על פלטפורמת ההדמיה (ראה טבלת חומרים) כדי להבטיח שטמפרטורת הגוף של העכבר תישמר במהלך ההדמיה. הפעל את כרית החימום וכוונן את הטמפרטורה ל -35 מעלות צלזיוס.
  2. הסר את כיסוי האבק והפעל את אופטלמוסקופ סריקת הלייזר. הניחו עדשת 55° על המכשיר.
  3. הגדר את תוכנת ההדמיה (ראה טבלת חומרים) והזן מידע חיוני, כולל גנוטיפ, מין, גיל וכו '. כאשר הפעלת ההדמיה מתחילה, בחר את IR (ערוץ אינפרא אדום) ללכידת תמונות ICGA.

2. הכנת בעלי חיים לפני ICGA ו-FA

  1. שקול את העכבר כדי לקבוע את כמות ההרדמה (קטמין/קסילזין 70-100/2.5-10 מ"ג/ק"ג, ראה טבלת חומרים) הדרושה.
    הערה: מיטוב המינון הוא חיוני מכיוון שהפרופיל המטבולי משתנה בין זני עכברים שונים. חיוני לקבוע את המינון המתאים כדי למנוע מהעכבר להתעורר לפני השלמת ההדמיה או הסיכון למנת יתר ולתמותה פוטנציאלית של בעלי חיים.
  2. השתמש מזרק סטרילי 1 מ"ל עם מחט 30-32 G כדי לספק הרדמה על ידי הזרקה intraperitoneal. צבוט בעדינות את אחת מכפות העכבר כדי לבדוק אם העכבר מורדם כראוי. אם בעל החיים מפגין תגובה או תנועה כלשהי, מומלץ להמתין זמן נוסף לפני שתמשיך לשלב הבא. זה מאפשר לחיה להתיישב ומבטיח תנאים אופטימליים עבור ההליכים הבאים.
  3. יש לתת טיפות תמיסה אופתלמית טרופיקמיד 1% כדי להרחיב את שתי העיניים של העכבר. יש להמתין לפחות 30 שניות לפני השימוש בטיפות הידרוכלוריד של 0.5% פרופרקאין (ראו טבלת חומרים) על שתי העיניים כדי להפחית את תנועת העיניים ואת המצמוץ. לאחר מכן יש להשתמש בטיפות ג'ל עיניים עם חומר סיכה.
    הערה: לאורך כל תקופת ההרדמה חשוב לטפל בבעיית היובש הקיצוני בעיני העכבר, שעלול להוביל לאטימות הקרנית. אטימות זו הופכת את ההדמיה הבאה למאתגרת בשל הראות הלקויה. כדי למנוע זאת, חשוב למרוח טיפות ג'ל עיניים סיכה ברציפות כדי לשמור על לחות עיני העכבר.
  4. הנח את העכבר על כרית מים מחוממת.
    הערה: עכברים הם בעלי יחס שטח פנים לנפח גבוה, וכתוצאה מכך אובדן חום מוגבר לסביבה. בשילוב עם ירידת הטמפרטורה הנגרמת על ידי הרדמה, זה יכול להוות סיכון משמעותי לעכבר, מה שעלול להוביל למוות עקב היפותרמיה. חשוב לנקוט באמצעי הזהירות הדרושים כדי למנוע היפותרמיה ולהבטיח את רווחתו של העכבר במהלך ההליך.
  5. הכינו תערובת בנפח 1:1 של ICG בנפח 2 מ"ג/מ"ל וצבע פלואורסצאין בנפח 20 מ"ג/מ"ל (ראו טבלת חומרים). יש לתת 250 μL של התערובת באמצעות הזרקה intraperitoneal באמצעות מזרק 1 מ"ל ומחט 32 גרם.
    1. הכנס את המחט ברביע השמאלי התחתון של בטן העכבר ליד הרגליים האחוריות בזווית מקבילה לעור העכבר כדי למנוע ניקוב איברים כלשהם.
    2. בזהירות למשוך את הבוכנה ולוודא כי שום דם לא נכנס כובע מזרק. המשיכו להזריק את הצבע לאט ובהתמדה, תוך שמירה על קצב עקבי.
      הערה: יש לסנן את צבע ה-ICG באמצעות מסנן מזרקים בגודל 0.22 מיקרומטר לפני השימוש.

3. ICGA ו-FA

  1. הנח את העכבר על כרית החימום של פלטפורמת ההדמיה כדי להתחיל בהדמיה.
  2. מקם את גוף העכבר בזווית של 45 מעלות למצלמה וסובב את ראשו מעט כלפי מטה. זה מאפשר לעצב הראייה להיות במרכז הפוקוס של המצלמה.
  3. בעזרת צמר גפן, נגבו בעדינות את העין כדי להסיר את שכבת טיפות העיניים או הג'לים של חומר הסיכה על העין המצולמת תחילה. הקפד למרוח את טיפות ג'ל הסיכה מיד לאחר השלמת הליך ההדמיה.
    הערה: לא מומלץ להשאיר את העין ללא שימון למשך יותר מדקה אחת בזמן הרדמה.
  4. הזז את המצלמה לכיוון עין העכבר. בחר את ערוץ FA ממודול הרכישה. ניתן להשתמש בלומינסנציה הנפלטת מתעלת FA כדי למקם במרכז קרנית העכבר למיקום מהיר יותר.
  5. מקם את ראש העכבר באופן שעצב הראייה ממורכז על המסך, תוך הימנעות מהצורך להטות את אופטלמוסקופ סריקת הלייזר בזווית. בצע התאמות קלות במיקום ראש העכבר כדי להשיג את היישור הרצוי.
  6. במודול הרכישה, בחר את ערוץ ICGA. ודא שעוצמת הלייזר מוגדרת ל- 100% ובחר באפשרות 55° כדי להתאים לעדשה המתאימה. זה מבטיח הגדרות אופטימליות עבור אופטלמוסקופ סריקת לייזר.
    הערה: כדי למנוע רוויית יתר, ייתכן שיהיה צורך להשתמש בעוצמת לייזר נמוכה יותר, בדרך כלל סביב 25%-50%, בעת הדמיה בשלב המוקדם. התאמת עוצמת הלייזר בטווח זה יכולה לסייע בצילום תמונות ברורות ומדויקות מבלי לגרום לרוויית יתר.
  7. כאשר העין תופסת את כל המסך בתוכנת ההדמיה, בצע התאמות להגדרות הרגישות והמיקוד כדי לקבל את התמונה הברורה ביותר של קרום CNV.
    1. סובב את הלחצן השחור העגול במודול הרכישה כדי להתאים את רגישות התמונה.
    2. סובב את הידית על האופטלמוסקופ כדי להתאים את המיקוד. המיקוד האופטימלי להדמיה של כלי הדם ברשתית באמצעות FA הוא בדרך כלל בטווח של 35-45 D (דיופטרים). מצד שני, המוקד האידיאלי להדמיה של הכורואיד באמצעות ICGA הוא בדרך כלל בין 10-15 D.
      הערה: בשל הגדלים השונים של קרום CNV, ייתכן שיהיה צורך להתאים את המיקוד ב 10-30 D כדי לקבל הדמיה אופטימלית של המורפולוגיה של כלי הדם.
  8. לאחר התאמת המיקוד והרגישות להשגת התמונה הטובה ביותר האפשרית, לחץ על הלחצן השחור העגול במודול הרכישה כדי לנרמל את התמונה. לאחר השלמת הנורמליזציה (כל המסגרות שנלכדו), לחץ על כפתור הרכישה בלוח מסך המגע כדי לשמור את התמונה. ייתכן שיהיה צורך להזיז את המצלמה כדי לצלם CNV מזוויות שונות. העכבר יכול גם להיות מכוון בתנוחות שונות כדי לספק את התמונה הטובה ביותר של נגע CNV.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים מחדש את המיקוד או המיקום של אופטלמוסקופ סריקת לייזר בעת צפייה בכלי הדם רחוק יותר לעצב הראייה.
  9. חזור לערוץ FA באמצעות מודול הרכישה. בצע את אותם השלבים המפורטים בשלבים 3.6-3.7 כדי להתאים את הרגישות והמיקוד של כל תמונה כדי ללכוד את הדליפה של נגע CNV.
    הערה: ודא שנבחרה הרגישות הנכונה כדי למנוע רוויית יתר של דליפת CNV ולהגדיל באופן מלאכותי את אזור הדליפה.
  10. דמיינו את "השלב המוקדם" של ICGA ו-FA 3-4 דקות לאחר ההזרקה.
    הערה: "השלב המוקדם" הוא הזמן שבו ניתן לראות את כלי הדם הכורואידיים בצורה ברורה וברורה. במהלך השלב האמצעי, המתרחש בדרך כלל בין 4-8 דקות, כלי הדם ברשתית ובכורואידים, דהויים ומפוזרים הרבה יותר. כאשר השלב המאוחר (>8-10 דקות) נכנס, הן כלי הדם הכורואידליים והן כלי הרשתית הופכים לבלתי ניתנים להבחנה. נגעי CNV היפרפלואורסצנטיים, לעומת זאת, מפגינים ניגודיות מקסימלית על רקע מופחת. תזמונים אלה שהוזכרו משתנים ותלויים בריכוז ובכמות של צבע ICG המוזרק. כמות גדולה יותר של צבע ICG נוטה להגדיל את ציר הזמן של כל שלב ולספק כלי דם מובחנים יותר. יש להגדיר שלב בהתבסס על תכונות המפתח המפורטות לעיל ולא על זמן מוחלט.
  11. לאחר שכל התמונות נרכשו, החל חומר סיכה ג'ל או משחה על עין העכבר בזהירות לפקח על העכבר על כרית החימום להתאוששות. זה בדרך כלל לוקח 1.5 שעות עבור העכבר כדי להתאושש באופן מלא.
  12. החזירו את העכברים לכלובים ולאזור ההחזקה המיועד לאחר שהתאוששו לחלוטין מההרדמה והיו ערים.
  13. לפני כיבוי מערכת ההדמיה והלייזר, יצאו את התמונות כקובצי TIFF או JPEG לצורך ניתוח בהמשך.

4. RPE/כורואיד להרכבה שטוחה וצביעה

  1. קבע את העיניים ב-4% פרפורמלדהיד למשך הלילה. לשטוף את העיניים עם PBS שלוש פעמים. הסירו את העדשה והקרנית.
  2. יש לדגור על העיניים בתמיסה חוסמת (10% אלבומין בסרום בקר, 0.6% טריטון X-100 ב-PBS) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. יש לחזור על שטיפת PBS שלוש פעמים.
  3. יש לדגור על העיניים עם נוגדן אקטין GS-IB4 Alexa-flour 568 מצומד ונוגדן אקטין שריר חלק נגד α (ראו טבלת חומרים) למשך הלילה בתמיסת החסימה.
  4. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS. דגרו על הדגימות עם נוגדן משני נגד ארנב עז Alexa Fluor 488 (ראו טבלת חומרים) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
  5. בצע 4 חיתוכים רדיאליים מהקצה לקו המשווה. בזהירות להסיר את הרשתית17.
    הערה: יש להקפיד על מנת להבטיח שהקרום הניאו-וסקולרי אינו מנותק בטעות.
  6. הרכיבו את הכורואיד השטוח על מגלשת זכוכית. דמיינו את ה- CNV באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעקבות הפרוטוקול, ICGA ו-FA בוצעו על CNV המושרה בלייזר בעכברים צעירים (7-9 שבועות) וזקנים (12-16 חודשים) C57BL/6J. FA מספק מידע על המיקום והדליפה של נגעי CNV (איור 1, פאנלים שמאליים), בעוד ICGA חושף את המורפולוגיה של כלי הדם של נגעי CNV (איור 1, פאנלים ימניים). בעכברים צעירים, CNV נימי שולט בנגעי CNV. לעומת זאת, עכברים זקנים מציגים CNV עורקי המאופיין בכלי דם גדולים, לולאות כלי דם וקשרים אנסטומוטיים. עכברים צעירים ומבוגרים כאחד מראים ראות ברורה של כלי הדם ברשתית ב-FA (איור 1, פאנלים שמאליים). בתמונות ICGA של עכברים צעירים, כלי הדם ברשתית אינם נראים לעין, וכלי הדם הכורואידיים נראים דהויים, מה שמצביע על השלב האמצעי של ICGA עם דגש על כלי הדם הכורואידיים. בתמונות ICGA של עכברים זקנים, ניתן לראות כלי דם רשתית חלקיים בעוד כלי הדם הכורואידיים נראים דהויים, מה שמרמז על השלב האמצעי עם המיקוד בין הרשתית לכורואיד בשל הגודל הגדול יותר של CNV עורקי בעכברים זקנים. CNV עורקי בעכברים זקנים מציג גודל CNV גדול יותר (איור 2) ודליפה משמעותית יותר בהשוואה ל-CNV נימי בעכברים צעירים. Immunostaining עם נוגדן אקטין שריר חלק מסמן בהרחבה את כלי הדם CNV בעכברים זקנים, ומאשר את המורפולוגיה העורקית (איור 3). לעומת זאת, כתמים מינימליים עם אקטין שריר α חלק נצפתה בכלי הדם של אתר הנגע של עכברים צעירים, בקנה אחד עם מורפולוגיה נימית.

Figure 1
איור 1: השוואה בין תמונות FA ו-ICGA המתארות CNV המושרה על-ידי לייזר בעכברים צעירים ומבוגרים. תמונות FA מציגות דליפה של נגעי CNV, בעוד ICGA מספק הדמיה של המורפולוגיה של כלי הדם. פסי קנה מידה: 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: כימות גודל נגע CNV בעכברים צעירים ומבוגרים בהתבסס על תמונות ICGA. אזורי CNV נמדדו, עם סך של 26 ו -14 כתמי לייזר שנותחו בעכברים צעירים ומבוגרים, בהתאמה. קווי שגיאה מייצגים ממוצע ± SD. ניתוח סטטיסטי נערך באמצעות מבחן t לא מזווג. P < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תמונות מייצגות של נגעי CNV בעכברים צעירים ומבוגרים, עם תווית משותפת עם אלקסה 568 איזולקטין ונוגדן אקטין נגד שרירים חלקים α על תושבות שטוחות RPE/כורואידים. הצבע האדום מייצג את Alexa 568 isolectin, ואילו הצבע הירוק מייצג אקטין שרירים α חלק (SMA). פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מחקר זה הדגים את השימוש באנגיוגרפיה ירוקה אינדוציאנינית (ICGA) כדי לזהות את המורפולוגיה של כלי הדם של ניאו-וסקולריזציה כורואידית עורקית ונימי (CNV) במודלים של עכברים עם CNV המושרה בלייזר. תכונות האור הקשור להמוגלובין והאינפרא אדום של צבע ירוק אינדוציאנין (ICG) אפשרו זיהוי של מורפולוגיה CNV, דבר מאתגר להשגה באמצעות אנגיוגרפיה פלואורסצאין (FA), השיטה הנוכחית המשמשת את קהילת המחקר.

השלב הקריטי הראשון בפרוטוקול הוא לוודא שהצבע מוזרק לחלל התוך צפקי מבלי לחדור לאיברים. מיקום הזרקה נכון ברביע השמאלי התחתון, עם זווית קטנה בין העור לשיפוע, תוך הימנעות מהחדרת המחט כולה, מאפשר ספיגה משופרת של צבע אינדוציאנין. הזרקת הצבע לאיבר עלולה לגרום לספיגה איטית יותר ולסיבוכים פוטנציאליים כגון חתך באיברי הבטן, דימום פנימי או זיהום. היבט מרכזי נוסף של ההליך הוא למרכז את עצב הראייה לפני רכישת תמונות כדי לראות את כל קוטר העין. זה דורש חפיפה בין עוצמת האור הנפלטת מערוץ FA ועין העכבר תוך שימת לב לתמונה על מסך המחשב. כדי לתקן את זווית האורך, עדיף להטות את ראש העכבר ישירות למקומו במקום לכוונן את המכונה למעלה או למטה, ולהבטיח ששדה הראייה המלא נלכד.

מחקרים קודמים הראו כי שימוש בחומרי הרדמה קטמין/קסילזין עלול לגרום לאטימות הקרנית18,19. זה יכול להיות ממוזער על ידי הפחתת כמות xylazine20. בנוסף, חשוב לשמור על לחות עקבית בקרנית כדי למנוע היווצרות קטרקט. ניתן להשיג זאת באמצעות טיפות עיניים או ג'ל סיכה. גורמים אלה הופכים חשובים במיוחד עם עלייה בתדירות ההדמיה והזדקנות המודל של בעלי החיים, שכן נזק מתמשך לקרנית משפיע על בהירות תמונות ICGA. לתקופות הדמיה ממושכות, ניתן לשנות את ההליך על ידי שימוש בעדשת מגע פולימתיל מתקרילט מעל תמיסת חיץ מבוססת ג'ל למניעת היווצרות קטרקט21.

שיטת ההזרקה היא מרכיב מכריע נוסף. בעוד מחקר זה מתמקד הזרקה intraperitoneal (IP), ההליך יכול להתבצע עם שינויים קלים באמצעות הזרקה תוך ורידי (IV), במיוחד הזרקת ורידים זנב. הזרקה תוך צפקית נבחרה בשל קלות ההישג שלה, במיוחד עם עכברים פיגמנטים, ואת האמינות שלה במהלך ההליך. זהו שיקול חשוב מכיוון שניסויים כמותיים על CNV דורשים עיבוד יעיל של מספר רב של עכברים. ללא קשר לשיטת ההזרקה, עדיין ניתן לרכוש את התכונות האנגיוגרפיות של CNV בשל גודלו הגדול ומיקומו בין הכורואיד לרשתית בעת אפיון סוגים שונים של נגעים כורואידיים במודל בעלי חיים. עם זאת, זה שונה עבור כלי דם כורואידיים פוליפואידים (PCV), תת-סוג נוסף של AMD רטוב, אשר ממוקם בעיקר בתוך הכורואיד ודורש הדמיית מסלול זמן IV-ICGA לאבחון מדויק22.

מגבלה אחת של FA/ICGA משולב היא השונות המוגברת בעת לכידת שלבים שונים של הפרשה CNV. התזמונים האופטימליים לשלבים מוקדמים ומאוחרים לא תמיד מתאימים לתמונות ICGA ו-FA אידיאליות, ודורשים זמן נוסף כדי להתאים את המיקוד בין שני המצבים עבור כל עין. היבט זה מועצם על ידי הליך הזרקת IP, אשר מציג שונות רבה יותר בתזמון של שלושת השלבים ומחייב זמן הדמיה ארוך יותר בהשוואה להזרקת ורידים זנב22. עם זאת, לגורמים אלה יש השפעה מינימלית על גילוי מורפולוגיה וסקולרית של CNV, והיתרונות של FA / ICGA משולבים עולים על מגבלות אלה.

מחקרים אחרונים מצביעים על כך שסוגים שונים של נגעי CNV, כגון CNV נימי או עורקי, מגיבים באופן שונה לטיפולים הנוכחיים נגד VEGF 9,16,17. לכן, קביעת המורפולוגיה של כלי הדם של נגעי CNV היא קריטית. עם זאת, שיטת הבחירה הנוכחית, FA, אינה מספקת מידע חיוני זה. מומלץ להשתמש ב-ICGA בקהילת המחקר להדמיית מודלים של AMD ניאו-וסקולרי. מחקר זה הראה כי ICGA ו- FA יכולים להתבצע בנוחות יחד כדי להעריך הן דליפה והן תכונות כלי דם של CNV עבור מחקרים מכניסטיים וטיפוליים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן BrightFocus, קרן מחקר הרשתית, קרן Mullen וקרן שרה קמפבל בלאפר ברפואת עיניים ל- YF, מענק ליבה של NIH 2P30EY002520 למכללת ביילור לרפואה, ומענק בלתי מוגבל למחלקה לרפואת עיניים במכללת ביילור לרפואה ממחקר למניעת עיוורון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
32-G Insulin Syringe MHC Medical Products NDC 08496-3015-01
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary antibody Invitrogen  A11008
Anti-α smooth muscle Actin antibody Abcam ab5694
Bovine Serum Albumin Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-2323 
C57BL/6J mice (7-9 weeks) The Jackson Laboratory Strain #:000664
Fluorescein Sodium Salt Sigma-Aldrich MFCD00167039
Gaymar T Pump Heat Therapy System Gaymar TP-500 Water circulation heat pump for mouse recovery after imaging
GenTeal Gel Genteal NDC 58768-791-15 Clear lubricant eye gel
GS-IB4 Alexa-Flour 568 conjugate Invitrogen  I21412
Heidelberg Eye Explorerer Heidelberg Engineering, Germany HEYEX2
Indocyanine Green Pfaultz & Bauer I01250
Ketamine Vedco Inc. NDC 50989-996-06
Paraformaldehyde Acros Organics  416785000
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) Sandoz NDC 61314-016-01
Spectralis Multi-Modality Imaging System Heidelberg Engineering, Germany SPECTRALIS HRA+OCT
Triton X-100  Sigma-Aldrich X100-1L
Tropicamide ophthalmic solution (1%) Bausch & Lomb NDC 24208-585-64 For dilation of pupils
Xylazine Lloyd Laboratories NADA 139-236

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fleckenstein, M., et al. Age-related macular degeneration. Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 1-25 (2021).
  2. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
  3. Maguire, M. G., et al. Five-Year outcomes with anti-vascular endothelial growth factor treatment of neovascular age-related macular degeneration: the comparison of age-related macular degeneration treatments trials. Ophthalmology. 123 (8), 1751-1761 (2016).
  4. Yang, S., Zhao, J., Sun, X. Resistance to anti-VEGF therapy in neovascular age-related macular degeneration: a comprehensive review. Drug Design, Development and Therapy. 10, 1857-1867 (2016).
  5. Ehlken, C., Jungmann, S., Böhringer, D., Agostini, H. T., Junker, B., Pielen, A. Switch of anti-VEGF agents is an option for nonresponders in the treatment of AMD. Eye. 28 (5), London, England. 538-545 (2014).
  6. Heier, J. S., et al. Intravitreal aflibercept (VEGF trap-eye) in wet age-related macular degeneration. Ophthalmology. 119 (12), 2537-2548 (2012).
  7. Rofagha, S., Bhisitkul, R. B., Boyer, D. S., Sadda, S. R., Zhang, K. SEVEN-UP Study Group Seven-year outcomes in ranibizumab-treated patients in ANCHOR, MARINA, and HORIZON: a multicenter cohort study (SEVEN-UP). Ophthalmology. 120 (11), 2292-2299 (2013).
  8. Krebs, I., Glittenberg, C., Ansari-Shahrezaei, S., Hagen, S., Steiner, I., Binder, S. Non-responders to treatment with antagonists of vascular endothelial growth factor in age-related macular degeneration. British Journal of Ophthalmology. 97 (11), 1443-1446 (2013).
  9. Mettu, P. S., Allingham, M. J., Cousins, S. W. Incomplete response to Anti-VEGF therapy in neovascular AMD: Exploring disease mechanisms and therapeutic opportunities. Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100906 (2021).
  10. Otsuji, T., et al. Initial non-responders to ranibizumab in the treatment of age-related macular degeneration (AMD). Clinical Ophthalmology (Auckland, N.Z). 7, 1487-1490 (2013).
  11. Cobos, E., et al. Association between CFH, CFB, ARMS2, SERPINF1, VEGFR1 and VEGF polymorphisms and anatomical and functional response to ranibizumab treatment in neovascular age-related macular degeneration. Acta Ophthalmologica. 96 (2), e201-e212 (2018).
  12. Kitchens, J. W., et al. A pharmacogenetics study to predict outcome in patients receiving anti-VEGF therapy in age related macular degeneration. Clinical Ophthalmology (Auckland, N.Z.). 7, 1987-1993 (2013).
  13. Rosenfeld, P. J., Shapiro, H., Tuomi, L., Webster, M., Elledge, J., Blodi, B. Characteristics of patients losing vision after 2 Years of monthly dosing in the phase III Ranibizumab clinical trials. Ophthalmology. 118 (3), 523-530 (2011).
  14. Spaide, R. F. Optical coherence tomography angiography signs of vascular abnormalization with antiangiogenic therapy for choroidal neovascularization. American Journal of Ophthalmology. 160 (1), 6-16 (2015).
  15. Lumbroso, B., Rispoli, M., Savastano, M. C., Jia, Y., Tan, O., Huang, D. Optical coherence tomography angiography study of choroidal neovascularization early response after treatment. Developments in Ophthalmology. 56, 77-85 (2016).
  16. Zhu, L., et al. Combination of apolipoprotein-A-I/apolipoprotein-A-I binding protein and anti-VEGF treatment overcomes anti-VEGF resistance in choroidal neovascularization in mice. Communications Biology. 3 (1), 386 (2020).
  17. Zhang, Z., Shen, M. M., Fu, Y. Combination of AIBP, apoA-I, and Aflibercept overcomes anti-VEGF resistance in neovascular AMD by inhibiting arteriolar choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (12), 2 (2022).
  18. Koehn, D., Meyer, K. J., Syed, N. A., Anderson, M. G. Ketamine/Xylazine-induced corneal damage in mice. PloS One. 10 (7), e0132804 (2015).
  19. Li, X. -T., Qin, Y., Zhao, J. -Y., Zhang, J. -S. Acute lens opacity induced by different kinds of anesthetic drugs in mice. International Journal of Ophthalmology. 12 (6), 904-908 (2019).
  20. Zhou, T. E., et al. Preventing corneal calcification associated with xylazine for longitudinal optical coherence tomography in young rodents. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 461-469 (2017).
  21. Ikeda, W., Nakatani, T., Uemura, A. Cataract-preventing contact lens for in vivo imaging of mouse retina. BioTechniques. 65 (2), 101-104 (2018).
  22. Kumar, S., Berriochoa, Z., Jones, A. D., Fu, Y. Detecting abnormalities in choroidal vasculature in a mouse model of age-related macular degeneration by time-course indocyanine green angiography. Journal of Visualized Experiments. 84, e51061 (2014).

Tags

מורפולוגיה של כלי הדם ניוון מקולרי הקשור לגיל ניאו-וסקולרי אנגיוגרפיה ירוקה אינדוציאנינית AMD ניאו-וסקולריזציה כורואידית AMD רטוב טיפולים נגד VEGF עמידות לטיפול CNV עורקי CNV נימי אנגיוגרפיה פלואורסצאין דפוסי דליפה מודלים עכברי CNV המושרים בלייזר מנגנונים ואסטרטגיות טיפול
אפיון מורפולוגיה וסקולרית של ניוון מקולרי נאו-וסקולרי הקשור לגיל על ידי אינדוציאנין אנגיוגרפיה ירוקה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Attarde, A., Riad, T. S., Zhang, Z., … More

Attarde, A., Riad, T. S., Zhang, Z., Ahir, M., Fu, Y. Characterization of Vascular Morphology of Neovascular Age-Related Macular Degeneration by Indocyanine Green Angiography. J. Vis. Exp. (198), e65682, doi:10.3791/65682 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter