Summary
Het huidige protocol schetst stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van intrathecale injecties bij neonatale muizen voor genbewerking en medicijnafgifte.
Abstract
Intrathecale injectie is een veelgebruikte procedure in zowel pediatrische als volwassen klinieken en dient als een effectief middel om medicijnen en behandelingen toe te dienen. Door medicijnen en behandelingen rechtstreeks in het hersenvocht van het centrale zenuwstelsel af te leveren, bereikt deze methode hogere gelokaliseerde geneesmiddelconcentraties en vermindert het systemische bijwerkingen in vergelijking met andere routes zoals intraveuze, subcutane of intramusculaire injecties. Het belang ervan reikt verder dan klinische omgevingen, aangezien intrathecale injectie een cruciale rol speelt in preklinische onderzoeken gericht op de behandeling van neurogenetische aandoeningen bij knaagdieren en andere grote dieren, waaronder niet-menselijke primaten. Ondanks de wijdverbreide toepassing brengt intrathecale injectie bij jongen, met name neonatale jongen, echter aanzienlijke technische uitdagingen met zich mee vanwege hun kleine formaat en fragiele aard. Succesvolle en betrouwbare toediening van intrathecale injecties bij pasgeboren muizen vereist nauwgezette aandacht voor detail en zorgvuldige afweging van verschillende factoren. Er is dus een cruciale behoefte aan een gestandaardiseerd protocol dat niet alleen instructies geeft, maar ook de belangrijkste technische overwegingen en goede laboratoriumpraktijken benadrukt om de consistentie van de procedure en de veiligheid en het welzijn van de dieren te waarborgen.
Om aan deze onvervulde behoefte te voldoen, presenteren we een gedetailleerd en uitgebreid protocol voor het uitvoeren van intrathecale injecties, specifiek bij pasgeboren pups op postnatale dag 1 (P1). Door de stapsgewijze instructies te volgen, kunnen onderzoekers vol vertrouwen intrathecale injecties uitvoeren bij neonatale pups, waardoor de nauwkeurige toediening van medicijnen, antisense-oligo's en virussen voor genvervanging of op genoombewerking gebaseerde behandelingen mogelijk wordt. Bovendien wordt het belang van het naleven van goede laboratoriumpraktijken benadrukt om het welzijn van dieren te behouden en betrouwbare experimentele resultaten te garanderen. Dit protocol heeft tot doel de technische uitdagingen aan te pakken die gepaard gaan met intrathecale injecties bij neonatale muizen, en uiteindelijk de vooruitgang op het gebied van neurogenetisch onderzoek te vergemakkelijken dat gericht is op het ontwikkelen van potentiële therapeutische interventies.
Introduction
Intrathecale (IT) injectie is een veel voorkomende klinische procedure die wordt gebruikt om medicijnen toe te dienen, hersenvocht te verzamelen en de intracraniale druk te handhaven bij zowel pediatrische als volwassen patiënten in klinieken 1,2. De toediening van medicijnen via intrathecale injectie is een effectieve aanpak om de medicatieconcentraties in het centrale zenuwstelsel (CZS) te verhogen en tegelijkertijd de systemische blootstelling te minimaliseren. Bijgevolg verhoogt deze methode de therapeutische werkzaamheid en vermindert het de bijwerkingen, vooralvoor temperatuurgevoelige geneesmiddelen en geneesmiddelen met een korte halfwaardetijd3.
In preklinische studies waarin nieuwe geneesmiddelen en behandelingen worden getest met behulp van knaagdiermodellen, is het absoluut noodzakelijk om een betrouwbare methode voor de toediening van geneesmiddelen te gebruiken die een grotere precisie en reproduceerbaarheid van de resultaten biedt 4,5. Voor preklinische studies die nieuwe behandelingen voor neurogenetische en neurologische ontwikkelingsstoornissen evalueren, is vroege behandeling cruciaal voor initiële proof-of-concept-studies, omdat wordt voorspeld dat eerdere interventies doorgaans gunstigere resultaten opleveren 6,7,8.
In vergelijking met conventionele intracerebroventriculaire (ICV) injecties brengen IT-injecties aanzienlijk lagere risico's met zich mee, omdat ze de noodzaak van directe penetratie door de hersenschors overbodig maken. Dit voordeel vermindert de potentiële schade aan regionaal corticaal weefsel en omliggende zenuwen aanzienlijk. Bovendien zorgen IT-injecties voor een ten minste vijfvoudige toename van het toedienbare volume van medicijnen door middel van een enkele injectie, waardoor de haalbaarheid van herhaalde toedieningen aanzienlijk wordt vergroot. Vanwege het kleine formaat en de fragiele aard van pasgeboren muizen is het uitvoeren van intrathecale injecties bij pasgeboren pups echter technisch uitdagend en vereist het gespecialiseerde technieken, apparatuur en nauwgezette behandeling.
Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol met stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van intrathecale injecties bij P1-pasgeboren pups. De belangrijkste overwegingen en goede laboratoriumpraktijken worden hier benadrukt om de consistentie van de toediening en de veiligheid en het welzijn van de dieren tijdens de procedure te waarborgen. Door dit protocol te volgen, kunnen onderzoekers vol vertrouwen experimenten uitvoeren met precisie en reproduceerbaarheid, terwijl mogelijke risico's of ongemak voor de dieren tot een minimum worden beperkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De beschreven procedures en protocollen waren in overeenstemming met de richtlijnen die zijn uiteengezet in de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Bovendien kregen de procedures goedkeuring van de Animal Care and Use Committee van de Yale University School of Medicine. Pasgeboren wildtype (WT) C57BL/6J mannelijke en vrouwelijke muizen werden gebruikt voor gepresenteerd onderzoek. De dieren zijn afkomstig van een commerciële bron (zie Materiaaltabel).
1. Voorbereiding van de werkruimte
- Bereid eerst de volgende items voor: nat ijs voor cryo-anesthesie, een lege kooi om de jongen van de moeder te scheiden, een ontleedmicroscoop, een lichtbron, een schoon oppervlak om het dier tijdens de injectie te plaatsen, wattenstaafjes, een verwarmingskussen, een spuit van 25/10 μL en een naald van 34 G/0,375"/ 12 DEG (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Cryo-anesthesie voor muizenpups met behulp van nat ijs is een optionele stap die bedoeld is om het hanteren te vergemakkelijken, de beweging van de pup te verminderen en mogelijk ongemak bij dieren te minimaliseren. Deze cryo-anesthesiestap kan ook het voordeel bieden van het verlagen van de intracraniale druk en het verminderen van volumegerelateerde complicaties 9,10. - Verplaats de pups naar een aparte kooi weg van de dam terwijl u ze vastpakt.
- Weeg elke pup en documenteer hun gewicht.
- Veeg de achterkant van de muis schoon met gaas en ethanol. Bevestig de tussenwervelruimte of, ten minste, de middellijn van het wervelkanaal (die rood zou moeten lijken bij P1-pups) met behulp van de ontleedmicroscoop (aanvullende video 1).
2. Procedure voor injectie
- Om een enkele pup te verdoven, plaatst u deze voorzichtig op een waterdichte barrière zoals een latex hoes of aluminiumfolie op een ijsbad gedurende 3-5 minuten. Het is belangrijk om het dier niet voor langere tijd op het ijs te laten staan, omdat dit potentiële risico's kan opleveren op onderkoelingsgerelateerde complicaties, waaronder ventriculaire fibrillatie, weefselhypoxie en metabole acidose.
OPMERKING: De duur van 3-5 minuten kan van geval tot geval verschillen. Beoordeel de tekenen van anesthesie, zoals niet reageren op een teenknijp, om de juiste duur te bepalen. - Terwijl het dier op het ijs ligt, vult u de spuit met 10 μL van de geneesmiddelformulering, viruspreparaat of controleer kunstmatig ruggenmergvocht, enz.
OPMERKING: Overweeg tijdens de leerfase de optie om hetzelfde volume gemengde 1% Fast Green-kleurstof te injecteren met de toedieningsmaterialen (zie Tabel met materialen). Dit kan helpen bij het visualiseren van het injectieproces en helpen bij het leren en verfijnen van de techniek. Pups die zijn geïnjecteerd met Fast Green Dye of soortgelijke materialen moeten kort na injectie worden geëuthanaseerd volgens het goedgekeurde protocol, omdat deze materialen kunnen leiden tot ontstekingsreacties of andere bijwerkingen bij dieren. - Zodra het dier volledig is verdoofd, zoals bevestigd door verminderde of afwezige lichaamsbewegingen, plaatst u de pups voorzichtig onder de microscoop.
- Palpeer met de linker wijsvinger en duim voorzichtig de tussenwervelruimte langs de middellijn, gelegen tussen de bilaterale bekkengordels (aanvullende video 1). Draai de basis van de staart voorzichtig een beetje om de middellijn van de wervelkolom te helpen identificeren.
- Pas de afschuining van de naald aan in de richting van de kop van het dier vóór injectie.
- Steek de naald voorzichtig in en kantel deze iets tot een hoek van 70°-80° op het punt waar de inkeping elkaar snijdt, terwijl u ervoor zorgt dat de spuit uitgelijnd blijft met het centrale sagittale vlak. Terwijl de naald contact maakt met het bot, verkleint u geleidelijk de hoek tot ongeveer 30° en schuift u de naald vervolgens ongeveer 2 mm in de tussenwervelruimte.
OPMERKING: Het vermogen van de naald om het hele lichaam lichtjes op te tillen is een teken van een succesvolle toegang tot de intradurale ruimte. - Injecteer langzaam tot 10 μL volume binnen 50-60 s. Houd de naald 10-20 seconden op zijn plaats nadat de bevalling is voltooid. Trek de naald met een zachte rotatie terug om lekken te voorkomen.
OPMERKING: Het cerebellum wordt groen voordat de naald wordt teruggetrokken. Ook is de langzame druk van cruciaal belang om een toename van de intracraniale druk in verband met de bevalling te voorkomen en om mogelijke complicaties te minimaliseren. Op basis van onze ervaring met injecties bij meer dan 500 pups, is het leveren van een volume van 10 μL gedurende 50-60 s optimaal.
3. Na injectie
- Breng een wattenstaafje aan op de injectieplaats als er bloed lekt.
OPMERKING: In de meeste gevallen zou er geen moeten zijn. Uit onze ervaring blijkt dat pups die zijn behandeld met sporen van lekkage of bloed nog steeds bruikbaar zijn, maar dat het nodig kan zijn om tijdens de gegevensanalyse een lagere dosis medicijnen of behandelingen te overwegen. - Plaats de pup op een verwarmingskussen en laat de pups 10-15 minuten volledig herstellen en opwarmen. Observeer de pups zorgvuldig om er zeker van te zijn dat ze alert zijn en actief bewegen voordat u ze terugbrengt naar hun huiskooi. Adequaat herstel van een muis wordt aangegeven door het herstel van de roze huidskleur, verhoogde spontane lichaamsbeweging en responsieve reacties op aanraking.
- Plaats de pup terug in de huiskooi en zorg ervoor dat de pup goed bedekt is met bodembedekking, nestje of beide. Dit zorgt ervoor dat de pup de nodige maternale zorg krijgt van het moederdier.
- Beoordeel het algemene uiterlijk en de activiteit dagelijks gedurende ten minste 3 dagen na de injectie. Een ziek uiterlijk en verminderde activiteit kunnen de kans op infectie, behandelingsgerelateerde bijwerkingen of andere complicaties, enz. vergroten. Raadpleeg indien nodig de dierenarts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesvolle intrathecale injectie resulteerde onmiddellijk in de wijdverbreide distributie van de toegediende oplossing, hoewel de werkelijke cellulaire penetratie afhing van de aard van de toegediende medicijnen en materialen. In deze studie gebruikten we Fast Green om de onmiddellijke resultaten na intrathecale injectie (IT) bij wildtype pasgeborenen te visualiseren (Figuur 1A-K) en vergeleken met conventionele intracerebroventriculaire (ICV) injectie (Figuur 1L-N). De resultaten op lange termijn (10 dagen na injectie) werden ook onderzocht met behulp van YFP-reportermuizen die werden geactiveerd door de toediening van op CRISPR/Cas9 gebaseerde genbewerking7. YFP-expressie werd op grote schaal waargenomen in het hele muizenbrein in vergelijking met niet-CRISPR/Cas9-behandelde muizen (Figuur 2). De expressie van YFP werd waargenomen in de meeste cellen bij een hogere vergroting. Injecties werden uitgevoerd bij meer dan 500 pasgeboren pups en meer dan 98% van de geïnjecteerde pups overleefde de procedure. Er werden geen schadelijke effecten op de overleving en gezondheid op lange termijn van behandelde jongen waargenomen (aanvullende figuur 1).
Figuur 1: Temporele en ruimtelijke verdeling van Fast Green kleurstof in muizenhersenen. (A) Grove observatie van muizen, waarbij geïnjecteerde en niet-geïnjecteerde muizen 5 minuten na intrathecale injectie worden vergeleken. (B) Visualisatie van de verdeling van Fast Green kleurstof in de hersenen van muizen vóór dissectie. (C-E) Verdeling van de kleurstof in ontlede hersenen 5 minuten na intrathecale toediening. (F-H) Verdeling van de kleurstof in ontlede hersenen 30 minuten na intrathecale toediening. (I-K) Verdeling van de kleurstof in ontlede hersenen 60 minuten na intrathecale toediening. (L-N) Ter vergelijking: de verdeling van de kleurstof in ontlede hersenen 40 minuten na intracerebroventriculaire toediening. Schaalbalk: 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Langetermijneffecten van intrathecaal toegediende CRISPR/Cas9-genbewerking. Wijdverspreide expressie van de YFP-reporter in de muizenhersenen na intrathecale injectie van CRISPR/Cas9-genbewerking: cerebellum (AF), posterieure cortex (DF) en prefrontale cortex (GI). Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Overlevingscurve van muizen met het Angelman-syndroom na intrathecale CRISPR-genbewerking. Overlevingscurve die de uitkomsten weergeeft van muizen met het Angelman-syndroom die CRISPR-genbewerking krijgen via intrathecale toediening, vergeleken met niet-behandelde en wildtype muizen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende video 1: Intrathecale injectieprocedure bij neonatale muizen. Video die het proces demonstreert van het toedienen van intrathecale injecties aan neonatale muizen. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beschreven wordt een stap-voor-stap procedure voor intrathecale injectie bij neonatale muizen (P1), resulterend in een wijdverbreide distributie van geneesmiddelen in hun hersenen. In vergelijking met de gebruikelijke intracerebroventriculaire injectiemethode voor het toedienen van medicatie aan neonatale muizen, waarbij de hersenschors wordt doorboord11, voorkomt intrathecale injectie direct letsel aan de hersenen van neonatale muizen als gevolg van naaldpenetratie. Vanwege de minimale invasiviteit kan intrathecale injectie indien nodig herhaaldelijk worden uitgevoerd, waarbij herhaalde toedieningen bij mensen in een klinische setting worden gesimuleerd12.
Veranderingen in intracraniale druk worden vaak geassocieerd met intrathecale injectie13, wat mogelijk kan leiden tot de afstoting en weigering van de moeder om te eten als gevolg van gedragsveranderingen bij de pups. Acute gedragsveranderingen of verminderde overleving bij geïnjecteerde pups zijn echter niet waargenomen. Evenzo is ongewoon of abnormaal gedrag geassocieerd met intrathecale injecties bij volwassenen niet opgemerkt (gegevens niet getoond).
Verschillende technische tips kunnen hebben bijgedragen aan het succes en zijn de moeite waard om te benadrukken. De langzamere injectiesnelheid is waarschijnlijk een belangrijke factor. Bovendien kan cryo-anesthesie de intracraniale druk vóór de injectie verminderen, waardoor de terugstroming tijdens de intrathecale injectie wordt geminimaliseerd en andere complicaties worden verminderd. Ten slotte kan de precisie van de injectieplaats ook van invloed zijn op het slagingspercentage.
Om de beste werkzaamheid via intrathecale toediening te bereiken, is het van cruciaal belang om de procedure zo snel mogelijk na de bevalling uit te voeren. Geneesmiddelen en andere stoffen die via intrathecale injectie worden toegediend, komen in de intrathecale ruimte terecht, de ruimte tussen de arachnoïdale mater- en pia mater-lagen van de hersenvliezen die de hersenen en het ruggenmerg omringen. Daarom passeren de medicijnen die via intrathecale injectie worden toegediend deze lagen van de hersenvliezen12. Bij knaagdieren, net als bij mensen, bestaan de hersenvliezen uit drie lagen: de dura mater, arachnoïdale mater en pia mater14. Deze membranen vormen zich tijdens de embryonale ontwikkeling en zijn volledig volgroeid op postnatale dag 2 (P2)15. Daarom wordt aanbevolen om een snel genotyperingsprotocol te gebruiken om de pups binnen een paar uur aan experimentele groepen toe te wijzen, vooral voor experimenten met dierlijke genotypen, zoals experimenten met het bewerken van genen. Hoe eerder de pups worden geïnjecteerd, hoe beter het resultaat. De injecties worden meestal binnen 3 uur na de geboorte voltooid. Dit tijdvenster stelt de geïnjecteerde geneesmiddelen in staat om de stroom van hersenvocht in het hersenparenchym te volgen, terwijl de ependymale bekleding nog onvolgroeid is en minder wordt beïnvloed door de grootte van de medicijndeeltjes. Het is vermeldenswaard de ontwikkelingsverschillen tussen mensen en muizen. P1 neonatale muizen komen overeen met het late zwangerschapsstadium van de ontwikkeling van de menselijke hersenen16. Resultaten van experimenten met P1 neonatale muizen dienen als waardevol proof of concept, maar voorzichtigheid is geboden bij het extrapoleren van deze resultaten naar mensen in translationele onderzoeksontwerpen.
Deze techniek wordt uitgedaagd door een beperkt toedieningstijdvenster en de behoefte aan hoogopgeleide onderzoekers. Hoge mortaliteit kan in verband worden gebracht met de procedure als de onderzoeker geen ervaring heeft. Het beperkte tijdsbestek vereist echter een verhoogd niveau van precisie en herhaalbaarheid binnen en tussen studies. Bovendien kunnen met voldoende oefening de vaardigheid en het slagingspercentage van deze methode aanzienlijk worden verbeterd.
Als de injecties correct worden uitgevoerd, wordt de overleving van geïnjecteerde pups voornamelijk beïnvloed door de zorg van de moeder. Het wordt aanbevolen om pleegvrouwtjesparen voor te bereiden op uw doelen. Als de beoogde pups in de middag van de injectiedag geen melkvlek op hun buik hebben, moeten ze onmiddellijk worden overgebracht naar het pleegvrouwtje. Vrouwtjesmuizen herkennen hun baby's aan geur. Daarom is het van cruciaal belang om te voorkomen dat tijdens en na de procedure onbekende geuren van onderzoekers of niet-verwante moederdieren bij de pups worden geïntroduceerd. De noodzaak van het gebruik van pleegvrouwtjes moet echter worden beoordeeld voor individuele experimenten. Het wordt ook aanbevolen om de procedure uit te voeren in een goed geventileerde ruimte, idealiter in een biologische zuurkast. Het mengen van de pups met het strooisel en de uitwerpselen van de moeder is ook nuttig. Na de eerste controle na de procedure wordt aanbevolen om de verstoring van de dam gedurende ten minste 3 dagen tot een minimum te beperken om stress te verminderen. Zoals bij elke chirurgische ingreep moet rekening worden gehouden met het risico op infectie na de procedure. Daarom moet tijdens de injectie strikte naleving van goede laboratoriumpraktijken voor steriele procedures worden gevolgd. Opgemerkt moet worden dat de intrathecale druk hoger is dan de externe omgeving, wat een natuurlijke bescherming biedt tegen infectie. De ervaring leert dat het aantal infecties na injectie zeldzaam is. Het wordt echter aanbevolen om gedurende ten minste 3 dagen na de injectie dagelijks het algemene uiterlijk en de activiteit van de pups te controleren om tekenen en symptomen van infectie of andere complicaties op te sporen. In speciale gevallen kan overleg met veterinaire diensten gerechtvaardigd zijn in plaats van het euthanaseren van pups met aanzienlijke complicaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
YHJ is mede-oprichter van Couragene, maar geen belangenverstrengeling voor dit project.
Acknowledgments
XNL wordt ondersteund door de Foundation for Angelman Syndrome Therapeutic (FAST) Postdoctoral Fellowship. YHJ wordt ook ondersteund door FAST en NIH Grant R01HD110195 en R01MH117289.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balance | Ohaus Corporation | 30253017 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Digital Microscope | RWD | DOM-1001 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190144 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Heating pad | RWD | 69020 | |
| Needles | Hamilton | 6PK (34/0.375”/4/12DEG)S | |
| Syringe | Hamilton | 1702RN | |
| Syringe Filters | Sigma | SLGVM33RS |
References
- Hoy, S. M. Onasemnogene abeparvovec: first global approval. Drugs. 79 (11), 1255-1262 (2019).
- Ramos, D. M., et al. Age-dependent SMN expression in disease-relevant tissue and implications for SMA treatment. J Clin Invest. 129 (11), 4817-4831 (2019).
- Fedorova, E., Battini, L., Prakash-Cheng, A., Marras, D., Gusella, G. L. Lentiviral gene delivery to CNS by spinal intrathecal administration to neonatal mice. J Gene Med. 8 (4), 414-424 (2006).
- Dindot, S. V., et al. An ASO therapy for Angelman syndrome that targets an evolutionarily conserved region at the start of the UBE3A-AS transcript. Sci Transl Med. 15, eabf4077 (2023).
- Amanat, M., Nemeth, C. L., Fine, A. S., Leung, D. G., Fatemi, A. Antisense oligonucleotide therapy for the nervous system: from bench to bedside with emphasis on pediatric neurology. Pharmaceutics. 14 (11), 2389 (2022).
- Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-Thalassemia. N Engl J Med. 384, 252-260 (2021).
- Gillmore, J. D., et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis. N Engl J Med. 385, 493-502 (2021).
- Krol, A., Feng, G. Windows of opportunity: timing in neurodevelopmental disorders. Curr Opin Neurobiol. 48, 59-63 (2018).
- Birg, T., et al. Brain temperature influences intracranial pressure and cerebral perfusion pressure after traumatic brain injury: A CENTER-TBI Study. Neurocrit Care. 35, 651-661 (2021).
- Rossi, S., Zanier, E. R., Mauri, I., Columbo, A., Stocchetti, N. Brain temperature, body core temperature, and intracranial pressure in acute cerebral damage. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 71 (4), 448-454 (2001).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. 91, e51863 (2014).
- Petrou, P., Kassis, I., Yaghmour, N. E., Ginzberg, A., Karussis, D. A phase II clinical trial with repeated intrathecal injections of autologous mesenchymal stem cells in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Front Biosci (Landmark Ed). 26 (10), 693-706 (2021).
- Kroin, J. S., et al. The mechanisms of intracranial pressure modulation by epidural blood and other injectates in a postdural puncture rat model. Anesth Analg. 95 (2), 423-429 (2002).
- Møllgård, K., et al. A mesothelium divides the subarachnoid space into functional compartments. Science. 379 (6627), 84-88 (2023).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8, e67680 (2013).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 160-107, 1-16 (2013).
