Microdissection laser des Drosophile Neurones périphériques
Summary
Dans cette vidéo, article, nous présentons une méthode pour isoler un ou plusieurs<em> Drosophile</em> Neurones DA à partir de larves du tiers utilisant la capture infrarouge (IR) classe de microdissection par capture laser (LCM). L'ARN obtenu à partir des neurones isolés peuvent être facilement utilisés pour des applications en aval, y compris qRT-PCR ou microréseau analyses.
Abstract
L'arborisation dendritique (da) des neurones du système nerveux périphérique chez la drosophile (SNP) fournissent un excellent modèle dans lequel d'étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents spécifiques à chaque classe 1,2 morphogenèse dendrite. Pour faciliter les analyses moléculaires des classes spécifiques de développement da neurone, il est vital d'obtenir ces cellules dans une population pure. Bien que toute une gamme de cellules différentes, et tissu-spécifique des techniques d'isolement d'ARN existent pour les cellules de drosophile, y compris magnétiques purification cellulaire perles basée 3,4, fluorescent tri cellulaire (FACS) 5-8, et l'ARN protéine de liaison des stratégies basées sur neuf, aucun des ces méthodes peuvent être facilement utilisées pour isoler une ou plusieurs classes spécifiques drosophile neurones DA avec un haut degré de précision spatiale. Microdissection par capture laser (LCM) a émergé comme un outil extrêmement puissant qui peut être utilisé pour isoler des types cellulaires spécifiques des sections de tissus avec un haut degré de résolution spatiale et de précision. L'ARN obtenu à partir de cellules isolées peuvent ensuite être utilisées pour des analyses, y compris qRT-PCR et profilage de l'expression biopuces dans un type cellulaire donné 10-16. À ce jour, LCM n'a pas été largement appliquée dans l'analyse des tissus et des cellules de drosophile 17,18, y compris les neurones DA à l'étape du stade larvaire tiers de développement.
Ici, nous présentons notre protocole optimisé pour l'isolation des neurones DA drosophile en utilisant l'infrarouge (IR) classe de LCM. Cette méthode permet la capture d'unique, spécifiques à chaque classe ou de plusieurs neurones DA avec une haute spécificité et la résolution spatiale. Appariés selon l'âge des larves troisième stade exprimer une HES-mCD8:: GFP 19 transgène sous le contrôle soit de la classe IV da neurone spécifique PPK-GAL4 20 conducteur ou le pan-da neurone spécifique 21-7-21 GAL4 chauffeur ont été utilisés pour ces expériences. L'ARN obtenu à partir des neurones da isolé est de très haute qualité et peuvent être directement utilisés pour des applications en aval, y compris les qRT-PCR ou microréseau analyses. Par ailleurs, ce protocole LCM peuvent être facilement adaptées pour capturer d'autres types de cellules de drosophile à divers stades de développement dépend du type de cellule spécifique, le modèle d'expression GAL4 axée sur la GFP.
Protocol
Discussion
Le protocole présentés ici décrit notre méthode optimisée pour l'isolement des neurones chez la drosophile périphérique via LCM. Alors que ce protocole a été conçu LCM pour l'isolement spécifique de simple, spécifiques à chaque classe ou de plusieurs neurones da drosophile de l'étape de troisième stade larvaire de développement, des modifications mineures du protocole pourrait être facilement adaptée à la capture d'autres types de cellules de drosophile de to…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les Drs. Yuh-Nung Jan et Wes Grueber pour fournir des stocks volantes utilisées dans cette étude, et Virginia Espina, Dr Emanuel Petricoin et le Dr Lance Liotta d'aide à la LCM. Les auteurs remercient F. Thomas et Kate Miller Jeffress Memorial Trust pour le soutien de cette recherche (DNC) et l'Université George Mason Provost s de bureau (EPRI).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Bioproducts | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution | |
| 2.5% Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | ||
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | ||
| Xylenes, histological grade | Fisher Scientific | X3S-4 | ||
| RNAse-free water | Fisher Scientific | BP561-1 | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Tissue-Tek | 4583 | ||
| PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions | |
| Thin walled reaction tube with domed cap | GeneAmp, Applied Biosystems | N8010611 | ||
| ExtracSure Sample Extraction Device | Molecular Devices | LCM 0208 | ||
| Incubation Block for sample extraction from CapSure HS Caps | Molecular Devices | LCM0505 | ||
| Alignment Tray for CapSure HS LCM Caps and ExtracSure Sample Extraction Devices | Molecular Devices | LCM0504 | ||
| CapSure HS LCM caps | Molecular Devices | LCM0213 | ||
| 75×100 mm glass slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | ||
| Tissue embedding molds | Fisher Scientific | NC9642669 | ||
| Polypropylene pestle for 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | ||
| 70% Ethanol; 95% Ethanol; 100% Ethanol | ||||
| Dry ice |
Equipment:
- Cryostat
- 50 ml conical tube for slide fixation, rinsing, trypsin treatment and ethanol/xylene dehydration
- -80°C freezer
- Incubator
- PixCell IIe LCM Instrument with Fluor 300 epifluorescence optics optimized for EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices)
References
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Wang, X., Starz-Gaiano, M., Bridges, T., Montell, D. Purification of specific cell populations from Drosophila tissues by magnetic bead sorting, for use in gene expression profiling. Nature Protocols. , (2008).
- Iyer, E. P. R., Iyer, S. C., Sulkowski, M. J., Cox, D. N. Isolation and purification of Drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting. J Vis Exp. 34, 2912-2917 (2004).
- Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A., Tirouvanziam, R., Tirouvanziam, R. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 2912-2917 (2004).
- Shigenobu, S., Arita, K., Kitadate, Y., Noda, C., Kobayashi, S. Isolation of germline cells from Drosophila embryos by flow cytometry. Dev. Growth Differ. 48, 49-57 (2006).
- Reeves, N., Posakony, J. W. Genetic programs activated by proneural proteins in the developing Drosophila PNS. Dev. Cell. 8, 413-425 (2005).
- Jinushi-Nakao, S. Knot/Collier and Cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, 963-978 (2007).
- Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging. Nucl. Acids Res. 33, (2005).
- Appay, V. Sensitive Gene Expression Profiling of Human T Cell Subsets Reveals Parallel Post-Thymic Differentiation for CD4+ and CD8+ Lineages. J. Immunol. 179, 7406-7414 (2007).
- Ginzinger, D. G. Gene quantification using real-time quantitative PCR: An emerging technology hits the mainstream. Exp. Hematol. 30, 503-512 (2002).
- Keays, K. M., Owens, G. P., Ritchie, A. M., Gilden, D. H., Burgoon, M. P. Laser capture microdissection and single-cell RT-PCR without RNA purification. J. Immunol. Methods. 302, 90-98 (2005).
- Volgin, D. V., Swan, J., Kubin, L. Single-cell RT-PCR gene expression profiling of acutely dissociated and immunocytochemically identified central neurons. J. Neurosci. Methods. 136, 229-236 (2004).
- Emmert-Buck, M. R. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
- Xiao, W. Gene expression profiling in embryonic mouse lenses. Mol. Vis. 12, 1692-1698 (2006).
- Scharschmidt, T. Analysis of human osteoarthritic connective tissue by laser capture microdissection and QRT-PCR. Connect. Tissue Res. 48, 316-323 (2007).
- Spletter, M. L. regulates Drosophila olfactory projection neuron identity and targeting specificity. Neural Dev. 2, 14-14 (2007).
- Hoopfer, E. D., Penton, A., Watts, R. J., Luo, L. Genomic analysis of Drosophila neuronal remodeling: a role for the RNA-binding protein Boule as a negative regulator of axon pruning. J. Neurosci. 28, 6092-6103 (2008).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 5199-5204 (2007).
- Espina, V. Laser capture microdissection. Nat. Prot. 1, 586-603 (2006).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25, 402-408 (2001).
