의 레이저 캡처 Microdissection Drosophila 주변 뉴런
Summary
이 동영상 기사에서 우리는 격리하는 방법을 제시 하나 또는 여러 개의<em> Drosophila</em적외선 촬영 (IR) 레이저 캡처 Microdissection (LCM)의 클래스를 사용하여 셋째 instar의 애벌레부터> DA의 뉴런. 분리된 뉴런에서 얻은 RNA는 쉽게 qRT – PCR 또는 microarray 분석을 포함하여 다운 스트림 애플 리케이션에 사용할 수 있습니다.
Abstract
Drosophila 주변 신경계 (PNS)의 돌기 arborization (DA) 뉴런 수업 관련 dendrite의 morphogenesis 1,2를 기본 분자 메커니즘을 조사에 훌륭한 모델 시스템을 제공합니다. 클래스 특정 DA 신경 발달의 분자 분석을 촉진하기 위하여, 그것은 순수한 인구에서 이러한 세포를 얻기 위해 매우 중요합니다. 다른 세포와 조직을 특정 RNA 격리 기술의 범위는 자석 구슬을 기반으로 세포 정화 3,4, 형광 활성 세포 정렬 (외과) 5-8, 그리고 전략 9 기반의 RNA 결합 단백질을 포함 Drosophila 세포, 존재하지만 아무것도 없어요 이러한 방법은 쉽게 공간 정밀도의 높은 학위를 하나 또는 여러 개의 클래스 특정 Drosophila 검찰의 뉴런을 분리 활용하실 수 있습니다. 레이저 캡처 Microdissection (LCM)은 공간 해상도와 정밀도의 높은 수준의 조직 섹션에서 특정 세포 유형을 분리하는 데 사용할 수있는 매우 강력한 도구로 떠오르고있다. 고립된 세포에서 얻은 RNA는 다음 qRT – PCR 및 특정 세포 유형 10-16 내의 microarray 표현 프로 파일링 포함하여 분석을 위해 사용될 수 있습니다. 지금까지, LCM은 널리 개발의 세 번째 instar의 애벌레 단계에서 검찰의 뉴런을 포함 Drosophila 조직 및 세포 17,18의 분석에 적용되지 않았습니다.
여기 LCM의 적외선 (IR) 클래스를 사용 Drosophila 검찰의 뉴런의 격리를위한 최적화된 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 높은 특이성과 공간 해상도를 가진 단일 클래스의 특정 또는 여러 DA 뉴런의 캡쳐하실 수 있습니다. UAS – mCD8을 표현하는 연령 일치 셋째 instar의 유충 :의 통제하에 GFP 19 transgene 중 하나는 클래스 IV 다 신경 세포 특정은 PPK – GAL4 20 드라이버 또는 팬 – DA 뉴런 특정 21-7 – GAL4 21 드라이버는이 사용되었습니다 실험. 절연 검사의 뉴런에서 얻은 RNA는 매우 높은 품질이며 직접 qRT – PCR 또는 microarray 분석을 포함하여 하류 응용 프로그램을 위해 사용될 수 있습니다. 또한,이 LCM 프로토콜은 쉽게 다른 Drosophila 세포 유형에게 세포 유형 GFP의 특정, GAL4 기반의 표현 패턴에 의존 개발의 다양한 단계를 캡처하는 적용할 수 있습니다.
Protocol
Discussion
여기에 제시 프로토콜은 LCM을 통해 Drosophila 주변 뉴런의 격리를위한 최적화된 방법을 설명합니다. 이 LCM 프로토콜이 개발의 세 번째 instar 애벌레 단계에서 단일 클래스의 특정 또는 여러 Drosophila 검찰의 뉴런의 구체적인 격리를 위해 설계되었습니다 동안, 프로토콜의 사소한 변경 사항은 즉시 모든 개발에서 다른 Drosophila 셀 유형의 캡처에 맞게 수 서로 다른 GAL4를 사용…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 DRS 감사합니다. LCM 도움이 연구에 사용된 비행 주식, 그리고 버지니아 Espina 박사 엠마누엘 Petricoin 박사 랜스 Liotta를 제공 Yuh – Nung 월 및 웨스 Grueber. 저자는이 연구의 지원 (DNC)와 조지 메이슨 대학 프로보의 사무소 (EPRI)에 대한 토마스 F.와 케이트 밀러 제프리스 기념 트러스트를 인정합니다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Bioproducts | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution | |
| 2.5% Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | ||
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | ||
| Xylenes, histological grade | Fisher Scientific | X3S-4 | ||
| RNAse-free water | Fisher Scientific | BP561-1 | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Tissue-Tek | 4583 | ||
| PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions | |
| Thin walled reaction tube with domed cap | GeneAmp, Applied Biosystems | N8010611 | ||
| ExtracSure Sample Extraction Device | Molecular Devices | LCM 0208 | ||
| Incubation Block for sample extraction from CapSure HS Caps | Molecular Devices | LCM0505 | ||
| Alignment Tray for CapSure HS LCM Caps and ExtracSure Sample Extraction Devices | Molecular Devices | LCM0504 | ||
| CapSure HS LCM caps | Molecular Devices | LCM0213 | ||
| 75×100 mm glass slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | ||
| Tissue embedding molds | Fisher Scientific | NC9642669 | ||
| Polypropylene pestle for 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | ||
| 70% Ethanol; 95% Ethanol; 100% Ethanol | ||||
| Dry ice |
Equipment:
- Cryostat
- 50 ml conical tube for slide fixation, rinsing, trypsin treatment and ethanol/xylene dehydration
- -80°C freezer
- Incubator
- PixCell IIe LCM Instrument with Fluor 300 epifluorescence optics optimized for EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices)
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