のレーザーキャプチャーマイクロダイセクションショウジョウバエ末梢ニューロン
Summary
このビデオ、記事では、単一または複数単離するための方法を提示<em>ショウジョウバエ</em赤外線キャプチャ（IR）レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）のクラスを使用して、三齢幼虫から> DAニューロン。分離された神経細胞から得られたRNAは、容易に定量RT – PCRやマイクロアレイ解析などのダウンストリームアプリケーションに使用することができます。
Abstract
ショウジョウバエ末梢神経系（PNS）の樹状分枝（DA）ニューロンはクラス特有の樹状突起の形態形成の1,2の分子メカニズムを調査するための優れたモデルシステムを提供しています。クラス固有のDAニューロンの発達の分子解析を容易にするために、それは純粋な集団で、これらの細胞を得ることが不可欠です。異なる細胞、および組織特異的なRNAの分離技術の範囲は、磁気ビーズをベースセル精製3,4、蛍光活性化細胞選別（FACS）5-8、およびRNA結合タンパク質に基づいて戦略を9日のなしを含むショウジョウバエの細胞にもありますが、これらのメソッドは、容易に空間的な精度の高い単一または複数のクラス固有のショウジョウバエ DAニューロンを単離するために利用することができます。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）は、空間分解能と高精度に組織切片から特定の細胞型を分離するために使用できる非常に強力なツールとして登場しました。単離された細胞から得られたRNAは、その後、定量RT – PCRおよび特定の細胞型10月16日内マイクロアレイの発現プロファイリングを含む、解析に使用することができます。日付に、LCMは広く開発の三齢幼虫期におけるDAニューロンを含むショウジョウバエの組織や細胞17,18、の分析に適用されていない。
ここでは、LCMの赤外線（IR）クラスを使用してショウジョウバエの DAニューロンの単離のために私達の最適化されたプロトコルを提示する。このメソッドは、高い特異性と空間分解能を持つ単一の、クラス固有のまたは複数のDAニューロンのキャプチャが可能になります。年齢をマッチさせたUAS – mCD8を表現する三齢幼虫：：クラスIV DAニューロンの特定のPPK – GAL4 20ドライバーまたはパン- DAニューロン固有のどちらの制御下にGFP 19遺伝子21 – 7 – GAL4 21ドライバは、これらのために使用された実験。孤立したDAニューロンから得られたRNAは非常に高品質のものであり、直接定量RT – PCRやマイクロアレイ解析などのダウンストリームアプリケーションに使用できます。さらに、このLCMプロトコルが容易にGFPの細胞型特異的、GAL4 –ドリブン発現パターンに応じて、さまざまな開発段階に依存する他のショウジョウバエの細胞タイプをキャプチャするために適応させることができます。
Protocol
Discussion
本明細書において提示されるプロトコルは、LCMを経由してショウジョウバエ末梢神経細胞の単離のための私達の最適化方法を説明します。このLCMプロトコルが開発の三齢幼虫の段階から、単一の、クラス固有のまたは複数のショウジョウバエ DAニューロンの特定の単離のために設計されたものですが、プロトコルのマイナーな修正は、容易に全ての発生から他のショウジョウ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、博士に感謝する。 LCMの支援のために本研究で使用したフライ株式、およびバージニアEspina、博士エマニュエルPetricoinと博士ランスリオッタを提供するための塩原-ティンニン月とウェスGrueber。著者らはこの研究の支援（DNC）とジョージメイソン大学の学長のオフィス（EPRI）のためにトーマスF.とケイトミラーJeffressメモリアルトラストを認める。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Bioproducts | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution | |
| 2.5% Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | ||
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | ||
| Xylenes, histological grade | Fisher Scientific | X3S-4 | ||
| RNAse-free water | Fisher Scientific | BP561-1 | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Tissue-Tek | 4583 | ||
| PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions | |
| Thin walled reaction tube with domed cap | GeneAmp, Applied Biosystems | N8010611 | ||
| ExtracSure Sample Extraction Device | Molecular Devices | LCM 0208 | ||
| Incubation Block for sample extraction from CapSure HS Caps | Molecular Devices | LCM0505 | ||
| Alignment Tray for CapSure HS LCM Caps and ExtracSure Sample Extraction Devices | Molecular Devices | LCM0504 | ||
| CapSure HS LCM caps | Molecular Devices | LCM0213 | ||
| 75×100 mm glass slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | ||
| Tissue embedding molds | Fisher Scientific | NC9642669 | ||
| Polypropylene pestle for 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | ||
| 70% Ethanol; 95% Ethanol; 100% Ethanol | ||||
| Dry ice |
Equipment:
- Cryostat
- 50 ml conical tube for slide fixation, rinsing, trypsin treatment and ethanol/xylene dehydration
- -80°C freezer
- Incubator
- PixCell IIe LCM Instrument with Fluor 300 epifluorescence optics optimized for EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices)
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