Summary

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

Published: May 24, 2010
doi:

Summary

במאמר וידאו זה אנו מציגים שיטה לבידוד יחידים או מרובים<em> תסיסנית</em> נוירונים דה מן הזחלים instar third באמצעות לכידת אינפרא אדום (IR) מעמד של Microdissection לכידת לייזר (LCM). RNA המתקבלים נוירונים בודדים יכולים לשמש בקלות עבור יישומים במורד הזרם כולל qRT-PCR או microarray מנתח.

Abstract

דנדריטים (דה) arborization נוירונים במערכת העצבים ההיקפית תסיסנית (PNS) לספק מערכת מודל מצוינת בה כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס בכיתה ספציפית המורפוגנזה 1,2 דנדריט. כדי להקל על ניתוח מולקולרי של מחלקה ספציפית דה נוירון פיתוח, חיוני להשיג תאים אלה באוכלוסייה טהור. למרות מגוון רחב של תאים שונים, ספציפיים רקמות טכניקות בידוד RNA קיימים תאים תסיסנית, כולל טיהור תא חרוז מגנטי מבוסס 3,4, תא פלורסנט מיון פעיל (FACS) 5-8, ו – RNA חלבון מחייב מבוסס אסטרטגיות 9, אף אחד שיטות אלה יכול להיות מנוצל בקלות לבידוד בודדות או מרובות בכיתה ספציפית תסיסנית נוירונים דה עם רמה גבוהה של דיוק מרחבית. Microdissection לייזר לכידת (LCM) התפתחה ככלי רב עוצמה שניתן להשתמש בהם כדי לבודד את סוגי תאים מסוימים ממקטעים רקמה עם רמה גבוהה של דיוק ברזולוציה מרחבית. RNA בתאים מבודדים המתקבל לאחר מכן ניתן להשתמש עבור ניתוחים כולל qRT-PCR ו פרופיל microarray ביטוי בתוך סוג תא נתון 10-16. עד כה, LCM לא הוחל נרחב בניתוח של רקמות ותאים תסיסנית 17,18, כולל נוירונים דה בשלב instar third הזחל של התפתחות.

כאן אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה שלנו הבידוד של נוירונים תסיסנית דה באמצעות מעמד אינפרא אדום (IR) של LCM. שיטה זו מאפשרת ללכוד של, נוירונים בודדים דה בכיתה ספציפית או מספר עם סגוליות גבוהה ברזולוציה מרחבית. גיל בהתאמה third הזחלים instar להביע כטב"מ-mCD8: 19-GFP transgene בשליטת גם את הרביעי בכיתה דה נוירון ספציפי פ.פ.ק.-20 GAL4 הנהג או פאן דה נוירון ספציפי 21-7 21-GAL4 הנהג שימשו אלה ניסויים. RNA המתקבלים נוירונים בודדים דה הוא באיכות גבוהה מאוד וניתן להשתמש בו ישירות ליישומים במורד הזרם, כולל qRT-PCR או microarray מנתח. יתר על כן, פרוטוקול זה LCM ניתן להתאים בקלות ללכוד סוגים אחרים תסיסנית תא בשלבים שונים של פיתוח תלויים בסוג תא מסוים, GAL4 מונחה דפוס הביטוי של ה-GFP.

Protocol

הערות כלליות על LCM של תסיסנית היקפיים נוירונים אפשר מ 6 שעות, עד שבוע או יותר עבור LCM בהתאם לסוג רקמה את מספר התאים הדרושים. כל ההליכים מתבצעים אך ורק RNAse ללא התנאים הבאים נהלים סטנדרטיים. הז?…

Discussion

פרוטוקול המוצגת כאן מתארת ​​את שיטת אופטימיזציה שלנו הבידוד של נוירונים תסיסנית הפריפריה באמצעות LCM. אמנם זה פרוטוקול LCM תוכנן עבור בידוד הספציפי של יחיד, מחלקה ספציפית או מספר הנוירונים תסיסנית דה משלב instar third הזחל של פיתוח, שינויים קלים של פרוטוקול יכול ב…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים בני הזוג. Yuh-Nung יאן ווס Grueber למתן מניות לטוס השתמשו במחקר זה, ווירג'יניה Espina, ד"ר עמנואל Petricoin ד"ר לאנס ליוטה לסיוע עם LCM. המחברים להכיר תומס פ קייט מילר Jeffress הזיכרון אמון על התמיכה של מחקר זה (DNC) ואת אוניברסיטת ג'ורג' מייסון מכללה משרד s (EPRI).

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)   MP Bioproducts PBS10X02 Diluted to 1X working solution
2.5% Trypsin   Sigma-Aldrich T1426  
RNase-AWAY   Sigma-Aldrich 83931  
Xylenes, histological grade   Fisher Scientific X3S-4  
RNAse-free water   Fisher Scientific BP561-1  
Optimal Cutting Temperature (OCT) compound   Tissue-Tek 4583  
PicoPure RNA Isolation Kit   Molecular Devices KIT0204 Follow manufacturer’s instructions
Thin walled reaction tube with domed cap   GeneAmp, Applied Biosystems N8010611  
ExtracSure Sample Extraction Device   Molecular Devices LCM 0208  
Incubation Block for sample extraction from CapSure HS Caps   Molecular Devices LCM0505  
Alignment Tray for CapSure HS LCM Caps and ExtracSure Sample Extraction Devices   Molecular Devices LCM0504  
CapSure HS LCM caps   Molecular Devices LCM0213  
75×100 mm glass slides   Fisher Scientific 12-544-3  
Tissue embedding molds   Fisher Scientific NC9642669  
Polypropylene pestle for 1.5 ml microcentrifuge tubes   USA Scientific 1415-5390  
70% Ethanol; 95% Ethanol; 100% Ethanol        
Dry ice        

Equipment:

  • Cryostat
  • 50 ml conical tube for slide fixation, rinsing, trypsin treatment and ethanol/xylene dehydration
  • -80°C freezer
  • Incubator
  • PixCell IIe LCM Instrument with Fluor 300 epifluorescence optics optimized for EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices)

References

  1. Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
  2. Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
  3. Wang, X., Starz-Gaiano, M., Bridges, T., Montell, D. Purification of specific cell populations from Drosophila tissues by magnetic bead sorting, for use in gene expression profiling. Nature Protocols. , (2008).
  4. Iyer, E. P. R., Iyer, S. C., Sulkowski, M. J., Cox, D. N. Isolation and purification of Drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting. J Vis Exp. 34, 2912-2917 (2004).
  5. Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A., Tirouvanziam, R., Tirouvanziam, R. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 2912-2917 (2004).
  6. Shigenobu, S., Arita, K., Kitadate, Y., Noda, C., Kobayashi, S. Isolation of germline cells from Drosophila embryos by flow cytometry. Dev. Growth Differ. 48, 49-57 (2006).
  7. Reeves, N., Posakony, J. W. Genetic programs activated by proneural proteins in the developing Drosophila PNS. Dev. Cell. 8, 413-425 (2005).
  8. Jinushi-Nakao, S. Knot/Collier and Cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, 963-978 (2007).
  9. Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging. Nucl. Acids Res. 33, (2005).
  10. Appay, V. Sensitive Gene Expression Profiling of Human T Cell Subsets Reveals Parallel Post-Thymic Differentiation for CD4+ and CD8+ Lineages. J. Immunol. 179, 7406-7414 (2007).
  11. Ginzinger, D. G. Gene quantification using real-time quantitative PCR: An emerging technology hits the mainstream. Exp. Hematol. 30, 503-512 (2002).
  12. Keays, K. M., Owens, G. P., Ritchie, A. M., Gilden, D. H., Burgoon, M. P. Laser capture microdissection and single-cell RT-PCR without RNA purification. J. Immunol. Methods. 302, 90-98 (2005).
  13. Volgin, D. V., Swan, J., Kubin, L. Single-cell RT-PCR gene expression profiling of acutely dissociated and immunocytochemically identified central neurons. J. Neurosci. Methods. 136, 229-236 (2004).
  14. Emmert-Buck, M. R. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
  15. Xiao, W. Gene expression profiling in embryonic mouse lenses. Mol. Vis. 12, 1692-1698 (2006).
  16. Scharschmidt, T. Analysis of human osteoarthritic connective tissue by laser capture microdissection and QRT-PCR. Connect. Tissue Res. 48, 316-323 (2007).
  17. Spletter, M. L. regulates Drosophila olfactory projection neuron identity and targeting specificity. Neural Dev. 2, 14-14 (2007).
  18. Hoopfer, E. D., Penton, A., Watts, R. J., Luo, L. Genomic analysis of Drosophila neuronal remodeling: a role for the RNA-binding protein Boule as a negative regulator of axon pruning. J. Neurosci. 28, 6092-6103 (2008).
  19. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
  20. Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
  21. Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 5199-5204 (2007).
  22. Espina, V. Laser capture microdissection. Nat. Prot. 1, 586-603 (2006).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25, 402-408 (2001).
check_url/fr/2016?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Iyer, E. P. R., Cox, D. N. Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons. J. Vis. Exp. (39), e2016, doi:10.3791/2016 (2010).

View Video