Лазерная Захват микродиссекции Drosophila Периферийные Нейроны
Summary
В этом видео-работе предлагается метод выделения одной или нескольких<em> Drosophila</em> Да нейроны от третьего возраста личинок через ИК-захвата (ИК) класса лазерной Захват микродиссекция (LCM). РНК получена из изолированных нейронов могут быть легко использованы для последующих применений, включая QRT-PCR или микрочипов анализа.
Abstract
Дендритные разветвление (да) нейронов дрозофилы периферической нервной системы (ПНС) обеспечивают отличную модель системы, в которой для расследования молекулярные механизмы, лежащие класса конкретных дендритов морфогенеза 1,2. Для облегчения молекулярный анализ класса конкретных да нейрона развития, жизненно важно, чтобы получить эти клетки в чистое населения. Хотя спектр различных клетки, ткани и конкретных методов изоляции РНК существуют для клеток дрозофилы, в том числе магнитные бусины основанные очистки ячейки 3,4, флуоресцентная Активированный сортировки клеток (FACS) 5-8, и РНК, белок стратегий 9, ни одна из эти методы могут быть легко использованы для выделения одного или нескольких классов конкретных дрозофилы да нейронов с высокой степенью пространственной точностью. Лазерная Захват микродиссекция (LCM) стала чрезвычайно мощный инструмент, который может быть использован для выделения специфических типов клеток из ткани участки с высокой степенью пространственного разрешения и точности. РНК получена из изолированных клеток могут быть использованы для анализа в том числе QRT-PCR и микрочипов профилирование экспрессии в течение определенного типа клеток 10-16. На сегодняшний день, НОК не была широко применяются в анализе тканей и клеток дрозофилы 17,18, в том числе да нейронов на третьем личиночного возраста стадии развития.
Здесь мы представляем наш оптимизированный протокол для изоляции нейронов дрозофилы да использованием инфракрасного (ИК) класс LCM. Этот метод позволяет захватывать одиночных, классовые или нескольких да нейроны с высокой специфичностью и пространственным разрешением. Возраст соответствием третьего возраста личинок выражения UAS-mCD8:: GFP 19 трансгенов, находящихся под контролем либо класс IV-да-нейрон конкретных ППК-GAL4 20 водителя или пан-да-нейрон конкретных 21-7-21 GAL4 водитель были использованы для этих экспериментов. РНК получена из изолированных нейронов, да очень высокого качества и могут быть непосредственно использованы для последующих применений, включая QRT-PCR или микрочипов анализа. Кроме того, этот протокол LCM могут быть легко приспособлены для захвата другой клетки дрозофилы типов различных этапах развития зависит от типа клеток конкретных, GAL4 управляемой выражение структуры GFP.
Protocol
Discussion
Протокол, представленные здесь описывает наш оптимизированный метод изоляции дрозофилы периферические нейроны через LCM. Хотя этот протокол LCM был разработан для конкретной изоляции одного, конкретного класса или нескольких нейронов дрозофилы да от третьего возраста личино?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора. Yuh-Нунг Ян и Уэс Grueber за предоставление летать запасы, используемые в этом исследовании, и Вирджиния Эспина, доктор Эмануэль Petricoin и доктор Ланс Лиотта за помощью в НОК. Авторы признают, Томас Ф. и Кейт Миллер Джеффресс Мемориального Фонда за поддержку этого исследования (РСК) и Университета Джорджа Мейсона проректор Офис (EPRI).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Bioproducts | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution | |
| 2.5% Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | ||
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | ||
| Xylenes, histological grade | Fisher Scientific | X3S-4 | ||
| RNAse-free water | Fisher Scientific | BP561-1 | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Tissue-Tek | 4583 | ||
| PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions | |
| Thin walled reaction tube with domed cap | GeneAmp, Applied Biosystems | N8010611 | ||
| ExtracSure Sample Extraction Device | Molecular Devices | LCM 0208 | ||
| Incubation Block for sample extraction from CapSure HS Caps | Molecular Devices | LCM0505 | ||
| Alignment Tray for CapSure HS LCM Caps and ExtracSure Sample Extraction Devices | Molecular Devices | LCM0504 | ||
| CapSure HS LCM caps | Molecular Devices | LCM0213 | ||
| 75×100 mm glass slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | ||
| Tissue embedding molds | Fisher Scientific | NC9642669 | ||
| Polypropylene pestle for 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | ||
| 70% Ethanol; 95% Ethanol; 100% Ethanol | ||||
| Dry ice |
Equipment:
- Cryostat
- 50 ml conical tube for slide fixation, rinsing, trypsin treatment and ethanol/xylene dehydration
- -80°C freezer
- Incubator
- PixCell IIe LCM Instrument with Fluor 300 epifluorescence optics optimized for EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices)
References
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Wang, X., Starz-Gaiano, M., Bridges, T., Montell, D. Purification of specific cell populations from Drosophila tissues by magnetic bead sorting, for use in gene expression profiling. Nature Protocols. , (2008).
- Iyer, E. P. R., Iyer, S. C., Sulkowski, M. J., Cox, D. N. Isolation and purification of Drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting. J Vis Exp. 34, 2912-2917 (2004).
- Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A., Tirouvanziam, R., Tirouvanziam, R. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 2912-2917 (2004).
- Shigenobu, S., Arita, K., Kitadate, Y., Noda, C., Kobayashi, S. Isolation of germline cells from Drosophila embryos by flow cytometry. Dev. Growth Differ. 48, 49-57 (2006).
- Reeves, N., Posakony, J. W. Genetic programs activated by proneural proteins in the developing Drosophila PNS. Dev. Cell. 8, 413-425 (2005).
- Jinushi-Nakao, S. Knot/Collier and Cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, 963-978 (2007).
- Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging. Nucl. Acids Res. 33, (2005).
- Appay, V. Sensitive Gene Expression Profiling of Human T Cell Subsets Reveals Parallel Post-Thymic Differentiation for CD4+ and CD8+ Lineages. J. Immunol. 179, 7406-7414 (2007).
- Ginzinger, D. G. Gene quantification using real-time quantitative PCR: An emerging technology hits the mainstream. Exp. Hematol. 30, 503-512 (2002).
- Keays, K. M., Owens, G. P., Ritchie, A. M., Gilden, D. H., Burgoon, M. P. Laser capture microdissection and single-cell RT-PCR without RNA purification. J. Immunol. Methods. 302, 90-98 (2005).
- Volgin, D. V., Swan, J., Kubin, L. Single-cell RT-PCR gene expression profiling of acutely dissociated and immunocytochemically identified central neurons. J. Neurosci. Methods. 136, 229-236 (2004).
- Emmert-Buck, M. R. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
- Xiao, W. Gene expression profiling in embryonic mouse lenses. Mol. Vis. 12, 1692-1698 (2006).
- Scharschmidt, T. Analysis of human osteoarthritic connective tissue by laser capture microdissection and QRT-PCR. Connect. Tissue Res. 48, 316-323 (2007).
- Spletter, M. L. regulates Drosophila olfactory projection neuron identity and targeting specificity. Neural Dev. 2, 14-14 (2007).
- Hoopfer, E. D., Penton, A., Watts, R. J., Luo, L. Genomic analysis of Drosophila neuronal remodeling: a role for the RNA-binding protein Boule as a negative regulator of axon pruning. J. Neurosci. 28, 6092-6103 (2008).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 5199-5204 (2007).
- Espina, V. Laser capture microdissection. Nat. Prot. 1, 586-603 (2006).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25, 402-408 (2001).
