Laser Capture Microdissection av Drosophila Neuron
Summary
I denna video-artikeln presenterar vi en metod för att isolera enstaka eller flera<em> Drosophila</em> Da nervceller från tredje INSTAR larver med hjälp av den infraröda capture (IR) klassen Laser Capture Microdissection (LCM). RNA från den isolerade nervceller lätt kan användas för nedströms applikationer inklusive QRT-PCR och microarray-metoder.
Abstract
Den dendritiska arborization (DA) nervceller i Drosophila perifera nervsystemet (PNS) ger en utmärkt modell system där för att undersöka de molekylära mekanismerna bakom klasspecifika 1,2 Dendrite morfogenes. För att underlätta molekylära analyser av klass-specifika da neuron utveckling är det viktigt att få dessa celler i en ren population. Även om en rad olika celler och vävnad-specifika RNA-tekniker isolering finns för Drosophila celler, inklusive magnetisk pärla baserat cell rening 3,4, Lysrör Aktiverat cellsortering (FACS) 5-8, och RNA-bindande protein strategier 9, ingen av dessa metoder kan lätt utnyttjas för att isolera en eller flera klass-specifika Drosophila da nervceller med en hög grad av rumslig precision. Laser Capture Microdissection (LCM) har visat sig vara ett mycket kraftfullt verktyg som kan användas för att isolera specifika celltyper från vävnadssnitt med en hög grad av rumslig upplösning och noggrannhet. RNA från isolerade celler kan sedan användas för analyser, inklusive QRT-PCR och microarray expression profiling inom viss celltyp 10-16. Hittills har LCM inte i stor utsträckning i analysen av Drosophila vävnader och celler 17,18, inklusive da nervceller vid den tredje INSTAR larvstadiet i utvecklingen.
Här presenterar vi våra optimerat protokoll för isolering av Drosophila da nervceller med hjälp av den infraröda (IR) klass av LCM. Denna metod gör det möjligt för fångst av enstaka, klass-specifika eller flera da nervceller med hög specificitet och rumslig upplösning. Åldersmatchade third INSTAR larver som uttrycker en YH-mCD8:: GFP 19 transgenen under kontroll av antingen klass IV da neuron specifika PPK-GAL4 20 förare eller den pan-da neuron specifika 21-7-GAL4 21 förare har använts för dessa experiment. RNA från den isolerade da nervceller är av mycket hög kvalitet och kan användas direkt för nedströms tillämpningar, inklusive QRT-PCR och microarray-metoder. Dessutom kan denna LCM protokoll vara lätt anpassas för att fånga andra Drosophila celltyper en olika stadier av utveckling beroende av celltyp specifika, GAL4 driven uttryck mönster av GFP.
Protocol
Discussion
Protokollet presenteras här beskriver vår optimerad metod för isolering av Drosophila perifera nervceller via LCM. Även om detta LCM protokoll var utformad för det specifika isolering av enstaka, klass-specifika eller flera Drosophila da nervceller från den tredje INSTAR larvstadiet i utvecklingen, kan mindre ändringar av protokollet lätt anpassas för fångst av andra Drosophila celltyper från alla utvecklingsstudier skeden med olika GAL4, UAS-mCD8-GFP reporter transgener so…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Yuh-nung Jan och Wes Grueber för att ge flugan lager som används i denna studie, och Virginia Espina, Dr Emanuel Petricoin och Dr Lance Liotta för hjälp med LCM. Författarna erkänner Thomas F. och Kate Miller Jeffress Memorial Trust för att stödja denna forskning (DNC) och George Mason University Provost kansli (EPRI).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Bioproducts | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution | |
| 2.5% Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | ||
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | ||
| Xylenes, histological grade | Fisher Scientific | X3S-4 | ||
| RNAse-free water | Fisher Scientific | BP561-1 | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Tissue-Tek | 4583 | ||
| PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions | |
| Thin walled reaction tube with domed cap | GeneAmp, Applied Biosystems | N8010611 | ||
| ExtracSure Sample Extraction Device | Molecular Devices | LCM 0208 | ||
| Incubation Block for sample extraction from CapSure HS Caps | Molecular Devices | LCM0505 | ||
| Alignment Tray for CapSure HS LCM Caps and ExtracSure Sample Extraction Devices | Molecular Devices | LCM0504 | ||
| CapSure HS LCM caps | Molecular Devices | LCM0213 | ||
| 75×100 mm glass slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | ||
| Tissue embedding molds | Fisher Scientific | NC9642669 | ||
| Polypropylene pestle for 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | ||
| 70% Ethanol; 95% Ethanol; 100% Ethanol | ||||
| Dry ice |
Equipment:
- Cryostat
- 50 ml conical tube for slide fixation, rinsing, trypsin treatment and ethanol/xylene dehydration
- -80°C freezer
- Incubator
- PixCell IIe LCM Instrument with Fluor 300 epifluorescence optics optimized for EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices)
References
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Wang, X., Starz-Gaiano, M., Bridges, T., Montell, D. Purification of specific cell populations from Drosophila tissues by magnetic bead sorting, for use in gene expression profiling. Nature Protocols. , (2008).
- Iyer, E. P. R., Iyer, S. C., Sulkowski, M. J., Cox, D. N. Isolation and purification of Drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting. J Vis Exp. 34, 2912-2917 (2004).
- Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A., Tirouvanziam, R., Tirouvanziam, R. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 2912-2917 (2004).
- Shigenobu, S., Arita, K., Kitadate, Y., Noda, C., Kobayashi, S. Isolation of germline cells from Drosophila embryos by flow cytometry. Dev. Growth Differ. 48, 49-57 (2006).
- Reeves, N., Posakony, J. W. Genetic programs activated by proneural proteins in the developing Drosophila PNS. Dev. Cell. 8, 413-425 (2005).
- Jinushi-Nakao, S. Knot/Collier and Cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, 963-978 (2007).
- Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging. Nucl. Acids Res. 33, (2005).
- Appay, V. Sensitive Gene Expression Profiling of Human T Cell Subsets Reveals Parallel Post-Thymic Differentiation for CD4+ and CD8+ Lineages. J. Immunol. 179, 7406-7414 (2007).
- Ginzinger, D. G. Gene quantification using real-time quantitative PCR: An emerging technology hits the mainstream. Exp. Hematol. 30, 503-512 (2002).
- Keays, K. M., Owens, G. P., Ritchie, A. M., Gilden, D. H., Burgoon, M. P. Laser capture microdissection and single-cell RT-PCR without RNA purification. J. Immunol. Methods. 302, 90-98 (2005).
- Volgin, D. V., Swan, J., Kubin, L. Single-cell RT-PCR gene expression profiling of acutely dissociated and immunocytochemically identified central neurons. J. Neurosci. Methods. 136, 229-236 (2004).
- Emmert-Buck, M. R. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
- Xiao, W. Gene expression profiling in embryonic mouse lenses. Mol. Vis. 12, 1692-1698 (2006).
- Scharschmidt, T. Analysis of human osteoarthritic connective tissue by laser capture microdissection and QRT-PCR. Connect. Tissue Res. 48, 316-323 (2007).
- Spletter, M. L. regulates Drosophila olfactory projection neuron identity and targeting specificity. Neural Dev. 2, 14-14 (2007).
- Hoopfer, E. D., Penton, A., Watts, R. J., Luo, L. Genomic analysis of Drosophila neuronal remodeling: a role for the RNA-binding protein Boule as a negative regulator of axon pruning. J. Neurosci. 28, 6092-6103 (2008).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 5199-5204 (2007).
- Espina, V. Laser capture microdissection. Nat. Prot. 1, 586-603 (2006).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25, 402-408 (2001).
