Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon Drosophila Periferik Nöronlar
Summary
Bu video makalede izole etmek için bir yöntem mevcut tek veya birden fazla<em> Drosophila</em> Kızılötesi yakalama (IR) Lazer Çekim Mikrodisseksiyon (LCM) sınıfı kullanarak üçüncü instar larvaları da nöronların. Izole nöronların elde edilen RNA kolayca QRT-PCR veya mikroarray analizleri de dahil olmak üzere aşağı uygulamalar için kullanılabilir.
Abstract
Drosophila periferik sinir sistemi (PNS) (da) nöronların dendritik arborization sınıfa özel dendrit morfolojilerinden 1,2 altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için mükemmel bir model sistemi sağlar. Moleküler analizlerin sınıf özgü da nöron gelişimi kolaylaştırmak için, saf bir nüfus bu hücreleri elde etmek için hayati önem taşımaktadır. Manyetik boncuk tabanlı hücre arıtma 3,4, Floresan Aktif Hücre Ayırma (FACS) 5-8 ve stratejileri 9 tabanlı RNA bağlayıcı protein de dahil olmak üzere Drosophila hücreler, farklı hücre ve doku-spesifik RNA izolasyon teknikleri bir dizi bulunmasına rağmen hiçbiri mekansal hassas bir yüksek derecesi ile tek veya birden fazla sınıf özel Drosophila da nöronların izole etmek için bu yöntemleri kolayca kullanılabilir. Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon (LCM), yüksek uzaysal çözünürlük ve doğruluk derecesi ile doku bölümleri belirli hücre türlerini izole etmek için kullanılabilecek bir derece güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Izole hücreler elde edilen RNA sonra Mah-PCR ve belirli bir hücre tipi 10-16 içinde mikroarray ifade profil de dahil olmak üzere analizler için kullanılabilir. LCM, bugüne kadar, üçüncü gelişim instar larval aşamada da nöronlar da dahil olmak üzere Drosophila doku ve hücreler 17,18, analizinde yaygın olarak uygulanan değil.
Burada LCM kızılötesi (IR) sınıfını kullanarak Drosophila da nöronların izolasyonu için optimize edilmiş protokol mevcut. Bu yöntem, yüksek özgüllük ve uzaysal çözünürlüğü ile tek, özel sınıf veya birden fazla da nöronların yakalamak için sağlar. UAS-mCD8 ifade Yaş uyumlu üçüncü instar larva: GFP 19 transgen kontrolü altında ya sınıfı IV da nöron spesifik PPK GAL4 20 sürücü veya pan-da nöron spesifik 21-7 GAL4 21 sürücü, bunlar için kullanılan deneyler. RNA izole da nöronların elde edilen çok yüksek kalitede ve doğrudan QRT-PCR veya mikroarray analizleri de dahil olmak üzere downstream uygulamalar için kullanılabilir. Ayrıca, bu LCM protokol diğer Drosophila hücre tipleri, hücre tipi GFP belirli, GAL4 odaklı ifade desen bağımlı bir kalkınma çeşitli aşamalarında yakalamak için kolayca adapte edilebilir .
Protocol
Discussion
Burada sunulan protokol LCM üzerinden Drosophila periferik nöronların izolasyonu için optimize edilmiş bir yöntem açıklanır . Bu LCM protokol gelişme üçüncü instar larva aşamasında tek, özel sınıf ya da birden fazla Drosophila da nöron spesifik izolasyonu için tasarlanmış iken, protokol küçük değişiklikler, kolaylıkla bütün gelişimsel diğer Drosophila hücre tipleri yakalamak için adapte olabilir aşamalarında, farklı GAL4 kullanarak, hücr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Dr teşekkür ederim. LCM yardım için bu çalışmada kullanılan sinek hisse senetleri, ve Virginia Espina, Dr. Emanuel Petricoin ve Dr Lance Liotta sağlamak için Yuh-Nung Jan ve Wes Grueber. Yazarlar bu araştırma desteği (DNC) ve George Mason Üniversitesi Provost Ofisi (EPRI) Thomas F. ve Kate Miller Jeffress Memorial Trust kabul etmiş sayılırsınız.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Bioproducts | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution | |
| 2.5% Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | ||
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | ||
| Xylenes, histological grade | Fisher Scientific | X3S-4 | ||
| RNAse-free water | Fisher Scientific | BP561-1 | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Tissue-Tek | 4583 | ||
| PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions | |
| Thin walled reaction tube with domed cap | GeneAmp, Applied Biosystems | N8010611 | ||
| ExtracSure Sample Extraction Device | Molecular Devices | LCM 0208 | ||
| Incubation Block for sample extraction from CapSure HS Caps | Molecular Devices | LCM0505 | ||
| Alignment Tray for CapSure HS LCM Caps and ExtracSure Sample Extraction Devices | Molecular Devices | LCM0504 | ||
| CapSure HS LCM caps | Molecular Devices | LCM0213 | ||
| 75×100 mm glass slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | ||
| Tissue embedding molds | Fisher Scientific | NC9642669 | ||
| Polypropylene pestle for 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | ||
| 70% Ethanol; 95% Ethanol; 100% Ethanol | ||||
| Dry ice |
Equipment:
- Cryostat
- 50 ml conical tube for slide fixation, rinsing, trypsin treatment and ethanol/xylene dehydration
- -80°C freezer
- Incubator
- PixCell IIe LCM Instrument with Fluor 300 epifluorescence optics optimized for EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices)
References
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Wang, X., Starz-Gaiano, M., Bridges, T., Montell, D. Purification of specific cell populations from Drosophila tissues by magnetic bead sorting, for use in gene expression profiling. Nature Protocols. , (2008).
- Iyer, E. P. R., Iyer, S. C., Sulkowski, M. J., Cox, D. N. Isolation and purification of Drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting. J Vis Exp. 34, 2912-2917 (2004).
- Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A., Tirouvanziam, R., Tirouvanziam, R. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 2912-2917 (2004).
- Shigenobu, S., Arita, K., Kitadate, Y., Noda, C., Kobayashi, S. Isolation of germline cells from Drosophila embryos by flow cytometry. Dev. Growth Differ. 48, 49-57 (2006).
- Reeves, N., Posakony, J. W. Genetic programs activated by proneural proteins in the developing Drosophila PNS. Dev. Cell. 8, 413-425 (2005).
- Jinushi-Nakao, S. Knot/Collier and Cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, 963-978 (2007).
- Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging. Nucl. Acids Res. 33, (2005).
- Appay, V. Sensitive Gene Expression Profiling of Human T Cell Subsets Reveals Parallel Post-Thymic Differentiation for CD4+ and CD8+ Lineages. J. Immunol. 179, 7406-7414 (2007).
- Ginzinger, D. G. Gene quantification using real-time quantitative PCR: An emerging technology hits the mainstream. Exp. Hematol. 30, 503-512 (2002).
- Keays, K. M., Owens, G. P., Ritchie, A. M., Gilden, D. H., Burgoon, M. P. Laser capture microdissection and single-cell RT-PCR without RNA purification. J. Immunol. Methods. 302, 90-98 (2005).
- Volgin, D. V., Swan, J., Kubin, L. Single-cell RT-PCR gene expression profiling of acutely dissociated and immunocytochemically identified central neurons. J. Neurosci. Methods. 136, 229-236 (2004).
- Emmert-Buck, M. R. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
- Xiao, W. Gene expression profiling in embryonic mouse lenses. Mol. Vis. 12, 1692-1698 (2006).
- Scharschmidt, T. Analysis of human osteoarthritic connective tissue by laser capture microdissection and QRT-PCR. Connect. Tissue Res. 48, 316-323 (2007).
- Spletter, M. L. regulates Drosophila olfactory projection neuron identity and targeting specificity. Neural Dev. 2, 14-14 (2007).
- Hoopfer, E. D., Penton, A., Watts, R. J., Luo, L. Genomic analysis of Drosophila neuronal remodeling: a role for the RNA-binding protein Boule as a negative regulator of axon pruning. J. Neurosci. 28, 6092-6103 (2008).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 5199-5204 (2007).
- Espina, V. Laser capture microdissection. Nat. Prot. 1, 586-603 (2006).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25, 402-408 (2001).
