Een High Throughput Scherm voor Biomining cellulase activiteit van Metagenomic Bibliotheken
Summary
Dit protocol beschrijft een high throughput scherm voor cellulolytische activiteit van een metagenomic bibliotheek uitgedrukt in Escherichia coli. Het scherm is oplossing gebaseerd en sterk geautomatiseerde, en maakt gebruik van een-pot chemie in 384 goed microtiterplaten met de uiteindelijke uitlezing als een absorptie meting.
Abstract
Cellulose is de meest voorkomende bron van organische koolstof op de planeet, heeft een brede industriële toepassingen met steeds meer nadruk op de productie van biobrandstoffen een. Chemische methoden aan te passen of af te breken cellulose vergen doorgaans sterke zuren en hoge temperaturen. Als zodanig zijn enzymatische methoden geworden prominent in het bioconversie proces. Terwijl de identificatie van de actieve cellulasen van bacteriën en schimmels geïsoleerd is enigszins effectief, de overgrote meerderheid van de microben in de natuur te weerstaan laboratorium teelt. Milieu-genoom, ook wel bekend als metagenomic, screening benaderingen zijn een grote belofte in het overbruggen van de kloof teelt in de zoektocht naar nieuwe bioconversie enzymen. Metagenomic screening benaderingen met succes hersteld roman cellulasen uit een omgeving net zo gevarieerd als de bodem 2, buffels pens 3 en de termiet achterste gut 4 met behulp van carboxymethylcellulose (CMC) agarplaten gekleurd met congo rode kleurstof (gebaseerd op de methode van Teather en Wood 5). Echter, de CMC methode is beperkt in de doorvoer, is niet kwantitatief en manifesteert zich een lage signaal-ruisverhouding 6. Andere methoden zijn gemeld van 7,8, maar elk gebruik een agarplaat-gebaseerde test, hetgeen ongewenst is voor high-throughput screening van grote insert genomische bibliotheken. Hier presenteren wij een oplossing op basis van het scherm voor het cellulase-activiteit met behulp van een chromogene dinitrofenol (DNP)-cellobioside substraat 9. Onze bibliotheek werd gekloneerd in de pCC1 Copy Control fosmid voor het testen van de gevoeligheid te verhogen door middel van copy number inductie 10. De methode maakt gebruik van een-pot chemie in 384-wells microtiterplaten met de uiteindelijke uitlezing die als een absorptie meting. Deze uitlezing is kwantitatief, gevoelig en geautomatiseerd met een doorvoersnelheid van maximaal 100X 384-well platen per dag met behulp van een vloeistof handler en plaat lezer met aangehechte stapelsysteem.
Protocol
Discussion
Een high throughput scherm voor de snelle detectie van cellulolytische activiteit van een grote insert genome DNA metagenomic bibliotheek expressie gebracht in E. coli is beschreven in dit protocol. Deze methode is een verbetering ten opzichte van de CMC / Congo Red assay vaak gebruikt in de literatuur. Het is oplossing gebaseerd, en maakt het mogelijk voor een-pot chemie screening in 384-well platen, met de uiteindelijke uitvoer als absorptie metingen van een plaat lezer waardoor kwantitatieve analyse. De auto…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen dr. Steve Withers en Hong-Ming Chen bedanken voor het verstrekken van DNP-Cellobioside substraat.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| qPix2 | Genetix | With 384-pin gridding head | ||
| qFill3 | Genetix | With 384-well manifold | ||
| Varioskan | Thermo-Fisher | |||
| RapidStak | Thermo-Fisher | Connected to Varioskan | ||
| Micro90 Detergent | Cole-Parmer | 18100-00 | Diluted to 2% in water | |
| Ethanol | Major Lab Supplier | Diluted to 80% in water | ||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | 12.5mg/mL in ethanol | |
| LB broth, Miller | Fisher | BP1426-2 | 25g/L, autoclaved | |
| 384-well flat bottom plates | Corning | 3680 | ||
| L-(+)-Arabinose | Sigma | A3256 | 100mg/mL in water | |
| Potassium Acetate | Fisher | P171 | 50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | ||
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | In TE buffer solution, 100mM | |
| EDTA disodium salt | Sigma | E5134 | In TE buffer solution, 10mM | |
| 2,4-dinitrophenyl cellobioside | Provided by Dr. Steve Withers, UBC | |||
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 |
References
- Rubin, E. M. Genomics of cellulosic biofuels. Nature. 454, 841-845 (2008).
- Voget, S., Steele, H. L., Streit, W. R. Characterization of a metagenome derived halotolerant cellulase. J. Biotechnol. 126, 26-36 (2006).
- Duan, C. J. Isolation and partial characterization of novel genes encoding acidic cellulases from metagenomes of buffalo rumens. J. Appl. Microbiol. 107, 245-256 (2009).
- Zhang, Y. H. P. Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies. Biotech. Advances. 24, 452-481 (2006).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl. And Environ. Microbiol. 43, 777-780 (1982).
- Sharrock, K. R. Cellulase assay methods: a review. J. Biochem and Biophys Methods. 17, 81-106 (1988).
- Kasana, R. C., Salwan, R., Dhar, H., Dutt, S., Gulati, A. A rapid and easy method for detection of microbial cellulases on agar plates using Gram’s Iodine. Curr. Microbiology. 57, 503-507 (2008).
- Huang, J. S., Tang, J. Sensitive assay for cellulase and dextranase. Anal. Biochem. 73, 369-377 (1976).
- Tull, D., Withers, S. G. Mechanisms of cellulases and xylanases: A detailed kinetic study of the exo-beta-1,4-glycanase from Cellulomonas fimi. Biochimie. 33, 6363-6370 (1994).
- Martinez, A., Bradley, A. S., Waldbauer, J. R., Summons, R. E., DeLong, E. F. Proteorhodopsin photosystem gene expression enables photophosphorylation in a heterologous host. PNAS. 104, 5590-5595 (2007).
- Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large Insert Environmental Genomic Library Production. J Vis Exp. , (2009).
- Martinez, A., Tyson, G. W., DeLong, E. F. Widespread known and novel phosphonate utilization pathways in marine bacteria revealed by functional screening and metagenomic analyses. Environ Microbiol. 12, 222-238 (2010).
- Wild, J., Hradecna, Z., Szybalski, W. Conditionally amplifiable BACs: Switching from single-copy to high-copy vectors and genomic clones. Genome Research. 12, 1434-1444 (2002).
- Johnson, E. A. Sacchirification of complex cellulosic substrates by the cellulase system from Clostridium thermocellum. Appl Environ Microbiology. 43, 1125-1132 (1982).
- Stutzenberger, F. J. Cellulase Production by Thermomonospora curvata isolated from municipal solid waste compost. Appl Environ Microbiol. 22, 147-152 (1971).
