Un écran à haut débit pour la bioprospection minière activité cellulase à partir des bibliothèques métagénomique
Summary
Ce protocole décrit un écran haut débit pour l'activité cellulolytique d'une banque métagénomique exprimé dans Escherichia coli. L'écran est la solution basée et hautement automatisé et utilise un pot de chimie dans des microplaques 384 puits avec la lecture finale comme une mesure d'absorbance.
Abstract
La cellulose, la source la plus abondante de carbone organique sur la planète, possède une vaste applications industrielles avec un accent croissant sur la production de biocarburants 1. Les méthodes chimiques de modifier ou de dégrader la cellulose exigent généralement les acides forts et des températures élevées. En tant que tel, les méthodes enzymatiques sont devenus importants dans le processus de bioconversion. Alors que l'identification des cellulases actifs à partir d'isolats bactériens et fongiques a été quelque peu efficaces, la grande majorité des microbes dans la nature résister à la culture en laboratoire. Génomique environnementale, aussi connu comme des approches métagénomique, de dépistage ont un grand potentiel pour combler le fossé de culture dans la recherche d'enzymes de bioconversion roman. Approches de dépistage métagénomique ont réussi à récupérer les cellulases roman d'environnements aussi variés que les sols 2, 3 buffles du rumen et l'intestin postérieur des termites 4 en utilisant des plaques d'agar carboxyméthylcellulose (CMC) tachés avec le Congo colorant rouge (basé sur la méthode de Teather et Wood 5). Cependant, la méthode MCC est limité dans le débit, n'est pas quantitatif et manifeste un signal faible à 6 bruit. D'autres méthodes ont été signalés, mais 7,8 chacun utiliser une plaque de gélose de base de test, qui est indésirable pour criblage à haut débit des grandes banques génomiques d'insertion. Nous présentons ici une solution à base d'écran pour l'activité cellulase en utilisant un dinitrophénol chromogène (DNP)-cellobioside substrat 9. Notre bibliothèque a été cloné dans le contrôle pCC1 copie fosmide pour augmenter la sensibilité du dosage par induction du nombre de copies 10. La méthode utilise un pot de chimie en microplaques 384 puits avec la lecture finale fournie comme une mesure d'absorbance. Cette lecture est quantitative, sensible et automatisé avec un débit allant jusqu'à 384 plaques 100X-même par jour en utilisant un gestionnaire de liquide et de lecteur de plaque avec le système d'empilage ci-joint.
Protocol
Discussion
Un écran à haut débit pour la détection rapide de l'activité cellulolytique partir d'une bibliothèque génomique insérez métagénomique grandes ADN exprimée dans E. coli est décrite dans ce protocole. Cette méthode est une amélioration par rapport au dosage de CMC / rouge Congo couramment utilisé dans la littérature. C'est une solution basée, et permet pour un pot de dépistage chimie en plaques 384 puits, avec la sortie finale lectures d'absorbance à partir d'un lecteur de p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Steve Withers et Hong-Ming Chen pour fournir des DNP-cellobioside substrat.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| qPix2 | Genetix | With 384-pin gridding head | ||
| qFill3 | Genetix | With 384-well manifold | ||
| Varioskan | Thermo-Fisher | |||
| RapidStak | Thermo-Fisher | Connected to Varioskan | ||
| Micro90 Detergent | Cole-Parmer | 18100-00 | Diluted to 2% in water | |
| Ethanol | Major Lab Supplier | Diluted to 80% in water | ||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | 12.5mg/mL in ethanol | |
| LB broth, Miller | Fisher | BP1426-2 | 25g/L, autoclaved | |
| 384-well flat bottom plates | Corning | 3680 | ||
| L-(+)-Arabinose | Sigma | A3256 | 100mg/mL in water | |
| Potassium Acetate | Fisher | P171 | 50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | ||
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | In TE buffer solution, 100mM | |
| EDTA disodium salt | Sigma | E5134 | In TE buffer solution, 10mM | |
| 2,4-dinitrophenyl cellobioside | Provided by Dr. Steve Withers, UBC | |||
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 |
References
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