Ein High-Throughput-Screen für Biomining Cellulase Aktivität von Metagenombanken
Summary
Dieses Protokoll beschreibt einen hohen Durchsatz Bildschirm für cellulolytische Aktivität von einem metagenomische Bibliothek in Escherichia coli exprimiert. Der Bildschirm ist Lösung und hoch automatisiert und nutzt Ein-Topf-Chemie in 384-Well-Mikroplatten mit dem letzten Auslesen als Extinktionsmessung.
Abstract
Cellulose, die ergiebigste Quelle von organischem Kohlenstoff auf der Erde, verfügt über weit reichende industrielle Anwendungen mit zunehmendem Schwerpunkt auf die Produktion von Biokraftstoffen 1. Chemische Methoden zu ändern oder zu degradieren Zellulose erfordern in der Regel starke Säuren und hohen Temperaturen. Als solche haben enzymatischen Methoden werden in der biologischen Umwandlung Prozess im Vordergrund. Während die Identifizierung von aktiven Cellulasen aus Bakterien und Pilzen isoliert wurde etwas effektiver, widerstehen die überwiegende Mehrheit der Mikroben in der Natur Labor Anbau. Environmental Genomics, auch als Metagenom, Screening-Ansätze bekannt sind äußerst viel versprechend bei der Überbrückung der Anbau Lücke in der Suche nach neuen Biokonversion Enzyme. Metagenomische Screening-Methoden erfolgreich neuartige Cellulasen aus Umgebungen wieder wie als Böden 2, Büffel Pansen 3 und die Termiten Enddarm 4 mit Carboxymethylcellulose (CMC)-Agarplatten mit Kongorot-Farbstoff (basierend auf der Methode der Teather und Holz 5) gefärbt vielfältig. Doch die CMC-Methode in den Durchsatz begrenzt ist, ist nicht quantitativ und manifestiert ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis 6. Andere Methoden wurden 7,8 berichtet, aber jeder Verwendung einer Agar-Platte-basierter Assay, was unerwünscht für das Hochdurchsatz-Screening von großen einfügen genomische Bibliotheken ist. Hier präsentieren wir eine Lösung basierende Bildschirm für Cellulase-Aktivität unter Verwendung eines chromogenen Dinitrophenol (DNP)-cellobiosid Substrat 9. Unsere Bibliothek wurde in den pCC1 Kopierschutz Fosmid zu Assaysensitivität durch Kopienzahl Induktion 10 erhöhen geklont. Das Verfahren nutzt Ein-Topf-Chemie in 384-Well-Mikroplatten mit der endgültigen Anzeige als Extinktionsmessung zur Verfügung gestellt. Diese Anzeige ist quantitativ, empfindlich und automatisiert mit einem Durchsatz von bis zu 100x 384-Well-Platten pro Tag mit einem Liquid Handler und Platten-Lesegerät mit angeschlossenem Stapelsystem.
Protocol
Discussion
Ein hoher Durchsatz-Bildschirm für den schnellen Nachweis von cellulolytische Aktivität aus einer großen einfügen genomischer DNA metagenomische Bibliothek in E. ausgedrückt coli ist in diesem Protokoll beschrieben. Diese Methode ist eine Verbesserung gegenüber dem CMC / Congo Red Assay häufig in der Literatur verwendet. Es ist Lösung, und ermöglicht die Ein-Topf-Chemie-Screening in 384-Well-Platten, mit der endgültigen Ausgabe als Absorptionswerte von einem Platten-Lesegerät ermöglicht fü…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Dr. Steve Withers und Hong-Ming Chen für die Bereitstellung von DNP-cellobiosid Substrat danken.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| qPix2 | Genetix | With 384-pin gridding head | ||
| qFill3 | Genetix | With 384-well manifold | ||
| Varioskan | Thermo-Fisher | |||
| RapidStak | Thermo-Fisher | Connected to Varioskan | ||
| Micro90 Detergent | Cole-Parmer | 18100-00 | Diluted to 2% in water | |
| Ethanol | Major Lab Supplier | Diluted to 80% in water | ||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | 12.5mg/mL in ethanol | |
| LB broth, Miller | Fisher | BP1426-2 | 25g/L, autoclaved | |
| 384-well flat bottom plates | Corning | 3680 | ||
| L-(+)-Arabinose | Sigma | A3256 | 100mg/mL in water | |
| Potassium Acetate | Fisher | P171 | 50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | ||
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | In TE buffer solution, 100mM | |
| EDTA disodium salt | Sigma | E5134 | In TE buffer solution, 10mM | |
| 2,4-dinitrophenyl cellobioside | Provided by Dr. Steve Withers, UBC | |||
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 |
References
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