Metagenomic 도서관에서 Cellulase 활동 Biomining에 대해 높은 처리량 화면
Summary
이 프로토콜은 대장균의 표현 metagenomic 도서관에서 cellulolytic 활동에 높은 처리량 화면을 설명합니다. 화면이 솔루션을 기반으로하고 고도의 자동화, 그리고 흡광도 측정으로 최종 판독과 384 잘 microplates에 한 냄비 화학을 사용합니다.
Abstract
셀룰로스, 지구상의 유기 탄소의 가장 풍부한 원천은, 생물 연료 생산 1 증가 중심으로 광범위한 산업 애플 리케이션을했다. 셀룰로스를 수정하거나 저하에 화학 방법은 일반적으로 강한 지방산과 높은 온도를 필요로합니다. 따라서, 효소 방법은 bioconversion 과정에서 두드러진되고 있습니다. 박테리아와 곰팡이 격리에서 Active cellulases의 식별은 다소 효과가있다지만, 자연 미생물의 대부분은 실험 재배에 저항. 또한 metagenomic, 심사 방식으로 알려진 환경 게놈은 소설 bioconversion 효소에 대한 검색 재배 격차를 브리징 큰 약속을했습니다. 토양 2, 버팔로 제일위 3 콩고 레드 염료 (테더와 우드 5 방법에 따라) 물들일 흰개미 뒷다리 – 직감 4 사용 carboxymethylcellulose (CMC) 한천 플레이트와 같은 다양한으로 Metagenomic 심사 방식이 성공적으로 환경에서 소설 cellulases를 발견했습니다. 그러나, CMC 메서드가 처리량 제한됩니다, 양적되지 않고 잡음 비율 6 낮은 신호를 승객 명단. 다른 방법은 7,8를보고 있지만 각 사용 대형 삽입 게놈 라이브러리의 높은 처리량 검사 바람직하지는 한천 플레이트 기반의 분석.했습니다 여기서 우리는 솔루션을 기반 chromogenic dinitrophenol (DNP) cellobioside 기판 9를 사용 cellulase 활동에 대한 화면을 제시한다. 우리 도서관은 복사 번호 유도 열을 통해 분석 감도를 높이기 위해 fosmid pCC1 복사 제어에 복제되었습니다. 방법은 흡광도 측정으로 제공되는 최종 판독과 함께 384 잘 microplates에 한 냄비 화학을 사용합니다. 이 저장되어 첨부 스태킹 시스템으로 액체 처리기 및 플레이트 판독기를 사용하여 하루에 100X 384 잘 접시 최대의 처리량과 양적 민감하고 자동으로 진행됩니다.
Protocol
Discussion
대형 삽입 게놈의 DNA의 metagenomic 라이브러리에서 cellulolytic 활동의 신속한 검출을위한 높은 처리량 화면 E.으로 표현 대장균이 프로토콜에 설명되어 있습니다. 이 방법은 일반적으로 문학에 사용되는 CMC / 콩고 레드 분석을 통해 개선이다. 이 솔루션을 기반으로하고, 정량 분석을 위해 허용하는 플레이트 판독기에서 흡광도 수치로 최종 출력으로 384 잘 접시에 한 냄비 화학 검사 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 DNP – Cellobioside 기판을 제공하는 스티브 위더스 및 홍콩 – 밍 첸 감사하고 싶습니다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| qPix2 | Genetix | With 384-pin gridding head | ||
| qFill3 | Genetix | With 384-well manifold | ||
| Varioskan | Thermo-Fisher | |||
| RapidStak | Thermo-Fisher | Connected to Varioskan | ||
| Micro90 Detergent | Cole-Parmer | 18100-00 | Diluted to 2% in water | |
| Ethanol | Major Lab Supplier | Diluted to 80% in water | ||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | 12.5mg/mL in ethanol | |
| LB broth, Miller | Fisher | BP1426-2 | 25g/L, autoclaved | |
| 384-well flat bottom plates | Corning | 3680 | ||
| L-(+)-Arabinose | Sigma | A3256 | 100mg/mL in water | |
| Potassium Acetate | Fisher | P171 | 50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | ||
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | In TE buffer solution, 100mM | |
| EDTA disodium salt | Sigma | E5134 | In TE buffer solution, 10mM | |
| 2,4-dinitrophenyl cellobioside | Provided by Dr. Steve Withers, UBC | |||
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 |
References
- Rubin, E. M. Genomics of cellulosic biofuels. Nature. 454, 841-845 (2008).
- Voget, S., Steele, H. L., Streit, W. R. Characterization of a metagenome derived halotolerant cellulase. J. Biotechnol. 126, 26-36 (2006).
- Duan, C. J. Isolation and partial characterization of novel genes encoding acidic cellulases from metagenomes of buffalo rumens. J. Appl. Microbiol. 107, 245-256 (2009).
- Zhang, Y. H. P. Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies. Biotech. Advances. 24, 452-481 (2006).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl. And Environ. Microbiol. 43, 777-780 (1982).
- Sharrock, K. R. Cellulase assay methods: a review. J. Biochem and Biophys Methods. 17, 81-106 (1988).
- Kasana, R. C., Salwan, R., Dhar, H., Dutt, S., Gulati, A. A rapid and easy method for detection of microbial cellulases on agar plates using Gram’s Iodine. Curr. Microbiology. 57, 503-507 (2008).
- Huang, J. S., Tang, J. Sensitive assay for cellulase and dextranase. Anal. Biochem. 73, 369-377 (1976).
- Tull, D., Withers, S. G. Mechanisms of cellulases and xylanases: A detailed kinetic study of the exo-beta-1,4-glycanase from Cellulomonas fimi. Biochimie. 33, 6363-6370 (1994).
- Martinez, A., Bradley, A. S., Waldbauer, J. R., Summons, R. E., DeLong, E. F. Proteorhodopsin photosystem gene expression enables photophosphorylation in a heterologous host. PNAS. 104, 5590-5595 (2007).
- Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large Insert Environmental Genomic Library Production. J Vis Exp. , (2009).
- Martinez, A., Tyson, G. W., DeLong, E. F. Widespread known and novel phosphonate utilization pathways in marine bacteria revealed by functional screening and metagenomic analyses. Environ Microbiol. 12, 222-238 (2010).
- Wild, J., Hradecna, Z., Szybalski, W. Conditionally amplifiable BACs: Switching from single-copy to high-copy vectors and genomic clones. Genome Research. 12, 1434-1444 (2002).
- Johnson, E. A. Sacchirification of complex cellulosic substrates by the cellulase system from Clostridium thermocellum. Appl Environ Microbiology. 43, 1125-1132 (1982).
- Stutzenberger, F. J. Cellulase Production by Thermomonospora curvata isolated from municipal solid waste compost. Appl Environ Microbiol. 22, 147-152 (1971).
