メタゲノムライブラリからセルラーゼ活性をBiominingためのハイスループットスクリーニング
Summary
このプロトコルは、大腸菌で発現メタゲノムライブラリーからのセルロース分解活性のためのハイスループットスクリーニングを説明します。画面には、ソリューションベースと高度に自動化され、吸光度測定など最終的な読み出しと384ウェルマイクロプレートでのワンポット化学を使用しています。
Abstract
セルロース、地球上の有機炭素の最も豊富な源は、バイオ燃料生産の1の増加を重視した幅広い産業用途を持っています。セルロースを変更したり、劣化させる化学的方法は、通常、強酸と高温を必要とする。このように、酵素法は、生物変換プロセスで顕著になっている。細菌および真菌分離株からのアクティブなセルラーゼの識別がやや効果があった一方で、自然界における微生物の大半は、実験室培養をレジスト。また、メタゲノム、スクリーニングの手法として知られている環境のゲノムは、新たな生物変換酵素の検索で栽培ギャップを埋めることに大きな期待を持っている。土壌2、水牛ルーメン3とコンゴレッド色素（Teatherとウッド5の方法に基づいて）で染色されたカルボキシメチルセルロース（CMC）寒天プレートを使用してシロアリ後肢腸4など様々なメタゲノムスクリーニングのアプローチが成功した環境からの新規セルラーゼを回復した。しかし、CMCメソッドは、スループットに制限され、定量的ではなく、ノイズ比6に低信号が現れます。他の方法は、7,8の報告が、それぞれが大規模な挿入のゲノムライブラリーのハイスループットスクリーニングのための望ましくない寒天プレートベースのアッセイを、使用されています。ここでは、ソリューションベースの発色ジニトロフェノール（DNP）- cellobioside基板9を使用して、セルラーゼ活性のための画面を提示する。私たちの図書館は、コピー数の誘導10を介して分析感度を向上させるフォスミドPCC1コピー制御にクローニングした。方法は、吸光度測定として提供される最終的な読み出しと384ウェルマイクロプレートでのワンポット化学を使用しています。この読み出しは、付属のスタッキングシステムを持つ液体ハンドラとプレートリーダーを使用して一日あたりの100倍、384ウェルプレートまでのスループットと、定量的な敏感と自動化です。
Protocol
Discussion
E.で表される大規模な挿入のゲノムDNAのメタゲノムライブラリーからのセルロース分解活性の迅速な検出のためのハイスループットスクリーニング大腸菌は、このプロトコルで説明されています。このメソッドは、一般的に文献で使用されるCMC /コンゴーレッドアッセイよりも優れています。それは解決策に基づいており、定量分析を可能にするプレートリーダーからの吸光度?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、DNP – Cellobioside基板を提供するための博士スティーブウィザースと弘明陳に感謝したいと思います。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| qPix2 | Genetix | With 384-pin gridding head | ||
| qFill3 | Genetix | With 384-well manifold | ||
| Varioskan | Thermo-Fisher | |||
| RapidStak | Thermo-Fisher | Connected to Varioskan | ||
| Micro90 Detergent | Cole-Parmer | 18100-00 | Diluted to 2% in water | |
| Ethanol | Major Lab Supplier | Diluted to 80% in water | ||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | 12.5mg/mL in ethanol | |
| LB broth, Miller | Fisher | BP1426-2 | 25g/L, autoclaved | |
| 384-well flat bottom plates | Corning | 3680 | ||
| L-(+)-Arabinose | Sigma | A3256 | 100mg/mL in water | |
| Potassium Acetate | Fisher | P171 | 50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | ||
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | In TE buffer solution, 100mM | |
| EDTA disodium salt | Sigma | E5134 | In TE buffer solution, 10mM | |
| 2,4-dinitrophenyl cellobioside | Provided by Dr. Steve Withers, UBC | |||
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 |
References
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