Diagnostic rapide du virus de la grippe aviaire chez les oiseaux sauvages: L'utilisation d'un portable RT-PCR et lyophilisés réactifs dans le domaine
Summary
Cette étude décrit le diagnostic de la grippe aviaire chez les oiseaux sauvages en utilisant un portable RT-PCR système. La méthode tire parti des réactifs lyophilisés à l'écran les oiseaux sauvages dans un cadre non-laboratoire, typique d'un scénario d'épidémie. L'utilisation d'outils moléculaires fournit des solutions de rechange précise et sensible pour le diagnostic rapide.
Abstract
Les oiseaux sauvages ont été impliqués dans la propagation de l'influenza aviaire hautement pathogène (IAHP) de sous-type H5N1, ce qui incite de surveillance le long des voies migratoires. L'échantillonnage des oiseaux sauvages du virus de la grippe aviaire (AIV) est souvent menée dans des régions éloignées, mais les résultats sont souvent retardées en raison de la nécessité de transporter les échantillons à un laboratoire équipé pour des tests moléculaires. En temps réel de la transcriptase inverse de la chaîne par polymérase (RT-PCR) est une technique moléculaire qui offre l'une des méthodes les plus précises et sensibles pour le diagnostic de l'AIV. Les protocoles de laboratoire préalablement strict nécessaire pour la RT-PCR sont maintenant adaptés pour le champ. Développement de réactifs lyophilisés (lyophilisé) qui ne nécessitent pas la chaîne du froid, avec une sensibilité au niveau des réactifs humide a amené les tests sur site distant à un but pratique.
Nous présentons ici une méthode pour le diagnostic rapide de l'AIV chez les oiseaux sauvages en utilisant une unité de RT-PCR (Ruggedized avancée des périphériques d'identification des agents pathogènes ou rapide, des technologies de l'Idaho, de Salt Lake City, UT) qui emploie des réactifs lyophilisés (grippe A Cible 1 Taqman; Asay -ASY-0109, Technologies Idaho). Les réactifs contiennent tous les composants nécessaires pour les tests à des concentrations appropriées dans un seul tube: amorces, des sondes, des enzymes, les tampons et les contrôles internes positifs, éliminant les erreurs liées à un mauvais entreposage ou la manipulation de réactifs humide. L'unité portable effectue un écran pour la grippe A en ciblant le gène de la matrice et donne des résultats en 2-3 heures. Sous-typage génétique est également possible avec un apprêt H5 et H7 jeux qui ciblent le gène hémagglutinine.
Le système est adapté pour une utilisation sur des échantillons cloacaux et oropharyngée prélevés sur des oiseaux sauvages, comme l'a montré ici sur les espèces de limicoles migrateurs, le bécasseau d'Alaska (Calidrus mauri) capturé en Californie du Nord. La manipulation des animaux suivis protocoles approuvés par le Comité de protection des animaux et de l'utilisation de l'US Geological Survey Western Centre de recherche écologique et permet de l'Oiseau US Geological Survey Banding Laboratory. Le principal avantage de cette technique est d'accélérer le diagnostic des oiseaux sauvages, ce qui augmente les chances de contenir une épidémie dans un endroit éloigné. Diagnostic sur site serait également s'avérer utile pour identifier et étudier les individus infectés dans les populations sauvages. La possibilité de collecter des informations sur la biologie hôte (réponse immunologique et physiologique à l'infection) et de l'écologie spatiale (performance migratoires des oiseaux infectés) fourniront un aperçu de la mesure dans laquelle les oiseaux sauvages peuvent agir comme des vecteurs de l'AIV sur de longues distances.
Protocol
Discussion
La méthode de diagnostic rapide facilite les tests présentés ici de temps précis et efficace des échantillons d'oiseaux sauvages pour la surveillance de l'AIV. Les exigences beaucoup moins strictes de stockage portables spécimen de RT-PCR sont adaptés à des situations isolées où le maintien d'une chaîne du froid peut être impraticable si les expéditeurs azote liquide ou de glace sèche n'est pas disponible. De plus, nous avons constaté que l'analyse de l'échantillon avec les réact…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier M. Scullion et R. Crisp des Technologies de l'Idaho pour le soutien technique et le Centre de recherche écologique USGS occidentaux pour le financement (S. Schwarzbach) et l'assistance (K. Spragens, T. Graham). Cette recherche a été réalisée sous les auspices du Centre pour la technologie innovatrice – Institut pour la Défense et la Sécurité intérieure (www.idhs.org), à l'appui du ministère de la Défense et Air Force Research Laboratory. La manipulation des animaux suivis protocoles approuvés par le Comité de protection des animaux et de l'utilisation de l'US Geological Survey Western Centre de recherche écologique et permet de l'Oiseau US Geological Survey Banding Laboratory. Toute utilisation des appellations commerciales, des produits, ou de l'entreprise dans cette publication est à des fins descriptives et n'implique pas l'approbation par le gouvernement américain.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| RNeasy mini spin column | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Collection tubes (1.5 & 2 mL) | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RLT | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RW1 | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RPE | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| RNase-free water | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| 14.3 M β-mercaptoethanol solution | Fisher Scientific | BP176100 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | NC9602322 | |
| Vortex Genie 2, 120V | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Taqman Influenza A Target 1 (Hydrolysis Probe) | Idaho Technologies | ASAY-ASY-0109 | |
| Lightcycler 20ml capillary tubes | Roche Applied Science | 04929292001 | |
| Micro-centrifuge with rotator for 2 ml tubes | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device (RAPID) 7200 | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Pentium-based laptop with Windows XP Professional | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Lightcycler Data Analysis software | Idaho Technologies | Included in RAPID kit |
References
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