Schnelle Diagnose der Aviären Influenza Virus bei Wildvögeln: Verwendung eines tragbaren rRT-PCR und gefriergetrocknet Reagenzien in das Feld
Summary
Diese Studie beschreibt Diagnose der Aviären Influenza bei Wildvögeln mit einem tragbaren rRT-PCR-System. Die Methode nutzt die Vorteile der gefriergetrockneten Reagenzien auf Wildvögel in einem Nicht-Labor-Einstellung, die typisch für einen Ausbruch Szenario Bildschirm. Verwenden von molekularen Werkzeugen bietet genaue und empfindliche Alternativen für eine schnelle Diagnose.
Abstract
Wildvögel haben in der Ausbreitung der hoch pathogenen aviären Influenza (HPAI) des Subtyps H5N1 in Verbindung gebracht, woraufhin die Überwachung an den Flugrouten. Probenahme von Wildvögeln auf Geflügelpest-Virus (AIV) wird oft in abgelegenen Regionen durchgeführt, aber die Ergebnisse sind oft wegen der Notwendigkeit, Proben an ein Labor für molekulare Tests ausgestattet Transport verzögert. Real-time-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RRT-PCR) ist eine molekulare Verfahren, das eine der genauesten und empfindlichsten Methoden für die Diagnose von AIV bietet. Die bisher strengen Labor-Protokolle für rRT-PCR benötigt werden derzeit für den Bereich angepasst. Entwicklung von gefriergetrockneten (lyophilisierten) Reagenzien, die keine Kühlkette, mit Sensibilität auf der Ebene der nassen Reagenzien gebracht hat Vor-Ort-Remote-Tests, um ein praktisches Ziel.
Hier präsentieren wir eine Methode zur schnellen Diagnose von AIV bei Wildvögeln mit einem rRT-PCR-Einheit (Ruggedized Erweiterte Pathogen Identification Device oder RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT), dass lyophilisierte Reagenzien beschäftigt (Influenza A Target 1 Taqman; Asay -ASY-0109, Idaho Technologies). Die Reagenzien enthalten alle erforderlichen Komponenten für die Prüfung bei entsprechenden Konzentrationen in einem einzigen Rohr: Primer, Sonden, Enzyme, Puffer und interne positive Kontrolle, Beseitigung von Fehlern mit unsachgemäße Handhabung oder Lagerung von nassen Reagenzien verbunden. Das tragbare Gerät führt einen Bildschirm für die Influenza A, indem sie auf der Matrix-Gen und liefert Ergebnisse innerhalb von 2-3 Stunden. Genetische Subtypisierung ist auch mit H5-und H7-Primer möglichen Mengen, die auf das Hämagglutinin-Gen.
Geeignet ist das System für den Einsatz auf Kloake und oropharyngealen Proben von Wildvögeln, wie hier auf dem wandernden shorebird Arten nachgewiesen, die westliche Flussuferläufer (Calidrus mauri) in Nordkalifornien aufgenommen. Behandlung der Tiere folgten Protokolle durch die Animal Care und Verwenden Ausschuss des US Geological Survey westlichen Ecological Research Center und erlaubt der US Geological Survey Vogel Banding Laboratory genehmigt. Der primäre Vorteil dieser Technik ist die Diagnose von Wildvögeln zu beschleunigen, die Erhöhung der Chancen der mit einem Ausbruch in einem Remote-Standort. On-site-Diagnose wäre auch nützlich für die Bestimmung und Analyse von infizierten Personen in Wildpopulationen. Die Möglichkeit, Informationen über die Host-Biologie (immunologische und physiologische Reaktion auf eine Infektion) und räumlicher Ökologie (wandernde Leistung von infizierten Vögeln) sammeln Einblicke in welchem Maße Wildvögel können als Vektoren für AIV über lange Distanzen zu fungieren.
Protocol
Discussion
Die Methode der schnellen Diagnose hier vorgestellten erleichtert zeiteffizient und genaue Prüfung von Wildvögeln Proben für die Überwachung von AIV. Die viel weniger strenge Probe Storage-Anforderungen von tragbaren rRT-PCR eignen sich für Situationen, in denen Remote-Wartung einer Kühlkette unpraktisch sein kann, wenn flüssigem Stickstoff Verlader oder Trockeneis ist nicht verfügbar. Darüber hinaus fanden wir, dass die Probenanalyse mit gefriergetrockneten Reagenzien war einfach genug, um von Feldbiologen mit…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten M. Scullion und R. Crisp of Idaho Technologies für den technischen Support und der USGS westlichen Ecological Research Center für die Finanzierung (S. Schwarzbach) und Hilfe (K. Spragens, T. Graham) zu danken. Institut für Verteidigung und Homeland Security (www.idhs.org), zur Unterstützung des Department of Defense und Air Force Research Laboratory – Diese Arbeit wurde unter der Schirmherrschaft des Zentrums für Innovative Technology durchgeführt. Behandlung der Tiere folgten Protokolle durch die Animal Care und Verwenden Ausschuss des US Geological Survey westlichen Ecological Research Center und erlaubt der US Geological Survey Vogel Banding Laboratory genehmigt. Jegliche Nutzung des Handels-, Produkt-oder Firmennamen in dieser Publikation ist lediglich für beschreibende Zwecke und nicht die Billigung durch die US-Regierung.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| RNeasy mini spin column | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Collection tubes (1.5 & 2 mL) | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RLT | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RW1 | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RPE | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| RNase-free water | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| 14.3 M β-mercaptoethanol solution | Fisher Scientific | BP176100 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | NC9602322 | |
| Vortex Genie 2, 120V | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Taqman Influenza A Target 1 (Hydrolysis Probe) | Idaho Technologies | ASAY-ASY-0109 | |
| Lightcycler 20ml capillary tubes | Roche Applied Science | 04929292001 | |
| Micro-centrifuge with rotator for 2 ml tubes | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device (RAPID) 7200 | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Pentium-based laptop with Windows XP Professional | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Lightcycler Data Analysis software | Idaho Technologies | Included in RAPID kit |
References
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