野鳥の鳥インフルエンザウイルスの迅速な診断：フィールドのポータブルRRT - PCR及び凍結乾燥試薬の使用
Summary
本研究では、ポータブルRRT – PCRシステムを使用して、野鳥における鳥インフルエンザの診断について説明します。方法は、アウトブレイクのシナリオの典型的な非実験室の設定で野鳥をスクリーニングするために凍結乾燥試薬、を活用しています。分子ツールの使用は、迅速な診断のための正確かつ敏感な選択肢を提供します。
Abstract
野生の鳥は渡り鳥フライウェイに沿って監視を促す、H5N1亜型の高病原性鳥インフルエンザ（HPAI）の拡散に関与している。鳥インフルエンザウイルス（AIV）のための野鳥のサンプリングは、多くの場合、遠隔地で行われているが、結果はしばしば分子検査のために装備研究所にサンプルを輸送する必要が遅延されています。リアルタイムの逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RRT – PCR）は、AIVの診断のための最も正確で高感度のいずれかの方法を提供する分子技術です。 RRT – PCRに必要な以前に厳格な実験室のプロトコルは現在、フィールドに適応されている。ウェット試薬のレベルでの感度を持つコールドチェーンを必要としないフリーズドライ（凍結乾燥）試薬の開発は、実用的な目標に、サイト上のリモートテストをもたらしています。
ここでは、凍結乾燥試薬を採用したRRT – PCRユニット（高耐久性高度病原体識別装置またはRAPID、アイダホテクノロジー、ソルトレイクシティ、ユタ州）（インフルエンザターゲット1タックマンを使用して野鳥のAIVの迅速な診断のための方法を提示する。Asay氏を – ASY – 0109、アイダホテクノロジーズ）。不適切な保管やウェット試薬の取り扱いに関連するエラーを排除し、プライマー、プローブ、酵素、緩衝液および内部陽性対照：試薬は、単一のチューブ内で適切な濃度でテストするために必要なすべてのコンポーネントが含まれています。ポータブルユニットは、2〜3時間でマトリックスの遺伝子と収量の結果を標的とすることでインフルエンザのための画面を実行します。遺伝的サブタイピングは、H5やH7プライマーでも可能です、そのターゲットの血球凝集素遺伝子を設定します。
システムは、渡り鳥シギチドリ類の種をここに示すように、野生の鳥から採取した、ヒメハマシギ（Calidrusマウリ ） は 、カリフォルニア北部でキャプチャされた総排泄腔と咽頭サンプルの使用に適しています。動物の扱いは、米国地質調査所西部生態学研究センターと実験室をバンディング米国地質調査所の鳥の許可の動物実験委員会によって承認されたプロトコールに従った。この技法の主な利点は、遠隔地での発生を含んでいる可能性を高める、野鳥の診断を促進することです。オンサイト診断も、野生の個体群に感染した個体を識別し、研究するために有用であることが分かるでしょう。ホストの生物学（感染症に対する免疫学的および生理学的応答）と空間的な生態学（感染した鳥の渡り鳥パフォーマンス）に関する情報を収集する機会は、野生の鳥が長距離のAIVのためのベクターとして動作できる範囲についての洞察を提供します。
Protocol
Discussion
ここで紹介する迅速な診断の方法は、AIVのサーベイランスのための野生の鳥のサンプルの時間効率と正確なテストを容易にします。液体窒素の荷主またはドライアイスが使用できない場合は、コールドチェーンの維持が不可能な場合がありますどこポータブルRRT – PCRのはるかに少ない厳しい試料のストレージ要件は、リモートの状況に適しています。さらに、我々は実験室ベースの分子解析?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、資金調達（S.シュワルツ）と援助（K. Spragens、T.グラハム）のための技術サポートとUSGS西部生態研究センターのためにM.皿洗いとアイダホテクノロジーのR.クリスプを感謝したい。防衛や空軍研究所の部門の支援の防衛と国土安全保障研究所（www.idhs.org）、 – この研究は、革新的技術センターの後援の下に行われた。動物の扱いは、米国地質調査所西部生態学研究センターと実験室をバンディング米国地質調査所の鳥の許可の動物実験委員会によって承認されたプロトコールに従った。この出版物の貿易、製品、または企業の名前のいずれかを使用するには、説明の提供のみを目的としており、米国政府による是認を意味するものではありません。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| RNeasy mini spin column | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Collection tubes (1.5 & 2 mL) | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RLT | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RW1 | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RPE | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| RNase-free water | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| 14.3 M β-mercaptoethanol solution | Fisher Scientific | BP176100 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | NC9602322 | |
| Vortex Genie 2, 120V | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Taqman Influenza A Target 1 (Hydrolysis Probe) | Idaho Technologies | ASAY-ASY-0109 | |
| Lightcycler 20ml capillary tubes | Roche Applied Science | 04929292001 | |
| Micro-centrifuge with rotator for 2 ml tubes | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device (RAPID) 7200 | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Pentium-based laptop with Windows XP Professional | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Lightcycler Data Analysis software | Idaho Technologies | Included in RAPID kit |
References
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