שיטה להגדרה של פעילות קינאז אצטט מתואר. Assay זה מנצל תגובה ישירה לקביעת פעילות האנזים ועל קינטיקה של קינאז אצטט בכיוון אצטט יוצרי עם acceptors phosphoryl שונים. יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מנוצל עבור assaying פוספט אצטיל אחרים או אצטיל-CoA אנזימים ניצול.
קינאז Acetate, חבר אצטט ו-kinase Hsp70-אקטין סוכר (ASKHA) אנזים superfamily 1-5, אחראי זירחון הפיך של אצטט כדי פוספט אצטיל ניצול ATP כמו המצע. קינאזות Acetate חיידקים נמצאים בכל מקום, נמצא סוג אחד של קדומים, והם נוכחים גם חיידקים של Eukarya 6. קינאז אצטט ביותר מאופיין גם הוא מן מתאן לייצור archaeon Methanosarcina thermophila 7-14. קינאז אצטט אשר יכול לנצל רק PP i-ATP, אך לא בכיוון אצטיל פוספט יוצרי כבר מבודד Entamoeba histolytica, הסוכן סיבתי של דיזנטריה אמבית, ויש לו עד כה נמצאו רק 15,16 הסוג הזה.
בכיוון של היווצרות אצטיל פוספט, פעילות קינאז אצטט נמדדת בדרך כלל באמצעות assay hydroxamate, שתוארה לראשונה על ידי ליפמן17-20, assay מצמידים שבו ההמרה של ה-ATP ל ADP היא מצמידים את החמצון של NADH ל NAD + ע"י קינאז האנזימים pyruvate ו לקטט דהידרוגנז 21,22, או מדידה assay שחרורו של פוספטים אנאורגניים אחרי התגובה של המוצר פוספט אצטיל עם hydroxylamine 23. פעילות ההיפך, אצטט יוצרי כיוון נמדד על ידי צימוד היווצרות ATP מ – ADP לצמצום NADP + ל NADPH ידי hexokinase האנזימים וגלוקוז 6 פוספט דהידרוגנז 24.
כאן אנו מתארים שיטה לגילוי של פעילות קינאז אצטט לכיוון היווצרות אצטט שאינו דורש צימוד אנזימים, אך הוא מבוסס על נחישות במקום ישירה של צריכת פוספט אצטיל. לאחר התגובה האנזימטית, פוספט אצטיל הנותרים מומר קומפלקס hydroxamate וברזל כי ניתן למדוד spectrophotometrically, כמו assay hydroxamate. לכן, בניגוד רחובassay מצמידים אנדאר עבור בכיוון הזה תלויה ייצור ATP מ – ADP, assay הזה ישיר יכול לשמש קינאזות אצטט המייצרים ATP או PP אני.
הגילוי של פוספט אצטיל ב assay זה תלוי בריכוז מספיק hydrochloride hydroxylamine ואת ריכוז החומציות של התמיסה כלורי וברזל. שינוי של נפח assay ידרוש בדיקה מחודשת של שני רכיבים אלה. תגובות אנזימטיות המתואר כאן בוצעו על 37 מעלות צלזיוס עם סיום hydroxylamine שבוצעה ב 60 ° C במשך 5 דקות. זו טמפרטורה גבו?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי הפרס NSF # 0920274 ודרום קרוליינה תחנת ניסוי פרויקט (SC-1700340) כדי KSS. נייר זה לא תרומה טכני 5929 של תחנת הניסיונות אוניברסיטת קלמסון.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Acetyl phosphate | Sigma Aldrich | 01409 | Lithium Salt (97% ) |
Sodium phosphate monobasic (dehydrate) | ThermoFisher | S381 | |
Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | ThermoFisher | S374 | |
Magnesium chloride (hexahydrate) | ThermoFisher | M33 | |
Tris Base | ThermoFisher | B152 | |
Ferric chloride (hexahydrate) | ThermoFisher | I88 | |
Trichloroacetic acid | ThermoFisher | A324 | |
Hydroxylamine hydrochloride | ThermoFisher | H330 | |
Adenosine 5’-diphosphate sodium salt |
Sigma Aldrich | A2754 | |
Biomate III Spectrophotometer | ThermoFisher | 142982082 | Standard UV/Vis spectrophotometer |