Rilevazione diretta della acetato di formazione Attività di acetato enzima chinasi
Summary
Un metodo per la determinazione dell'attività acetato chinasi è descritto. Questo test utilizza una reazione diretta per determinare l'attività enzimatica e la cinetica di acetato chinasi in acetato che formano direzione con diversi accettori fosforil. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per il saggio altro acetil fosfato o acetil-CoA che utilizzano enzimi.
Abstract
Chinasi acetato, un membro della acetato e zucchero chinasi-Hsp70-actina (ASKHA) superfamiglia degli enzimi 1-5, è responsabile della fosforilazione reversibile tra acetato e fosfato acetil utilizzando ATP come substrato. Chinasi acetato sono onnipresenti nei batteri, che si trova in un genere di Archaea, e sono presenti anche nei microbi del Eukarya 6. Le chinasi acetato più ben caratterizzato è che dal metano che producono archaeon Methanosarcina thermophila 7-14. Un acetato chinasi che può utilizzare solo i PP ma non ATP in direzione della acetil-fosfato formano è stato isolato da Entamoeba histolytica, l'agente eziologico della dissenteria amebica, e finora state trovate solo in questo genere 15,16.
In direzione della formazione di acetil-fosfato, acetato chinasi attività è in genere misurata mediante il test hydroxamate, in primo luogo descritto da Lipmann17-20, un test accoppiato in cui è accoppiato conversione di ATP in ADP all'ossidazione del NADH a NAD + dal piruvato chinasi enzimi e lattico deidrogenasi 21,22, o un saggio di misurazione rilascio di fosfato inorganico dopo la reazione del prodotto acetil fosfato con idrossilammina 23. L'attività in senso opposto, acetato di formazione direzione si misura con accoppiamento formazione di ATP da ADP alla riduzione del NADP + a NADPH dagli enzimi esochinasi e glucosio-6-fosfato deidrogenasi 24.
Qui si descrive un metodo per l'individuazione di attività chinasi acetato nella direzione della formazione di acetato che non richiede enzimi di accoppiamento, ma è invece basato sulla determinazione diretta del consumo di acetil fosfato. Dopo la reazione enzimatica, rimanendo acetil-fosfato viene convertito in un complesso hydroxamate ferrico che può essere misurato spettrofotometricamente, come per il test hydroxamate. Così, a differenza del stANDARD test accoppiato per questa direzione che dipende dalla produzione di ATP da ADP, questo saggio diretto può essere utilizzato per chinasi acetato che producono ATP o PP i.
Protocol
Discussion
Il rilevamento di fosfato di acetile in questo saggio dipende da una concentrazione sufficiente di cloridrato di idrossilammina e la concentrazione e l'acidità della soluzione di cloruro ferrico. Alterazione del volume test richiederà riconsiderazione di entrambi questi componenti. Le reazioni enzimatiche qui descritti sono stati eseguiti a 37 ° C con la cessazione idrossilammina eseguita a 60 ° C per 5 minuti. Questa temperatura più alta è fondamentale per consentire la rapida conversione del restante acetil …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal premio NSF # 0920274 e South Carolina Experiment Stazione Project (SC-1700340) per KSS. Questa carta è No. contributo tecnico 5929 della Stazione Clemson Experiment University.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Acetyl phosphate | Sigma Aldrich | 01409 | Lithium Salt (97% ) |
| Sodium phosphate monobasic (dehydrate) | ThermoFisher | S381 | |
| Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | ThermoFisher | S374 | |
| Magnesium chloride (hexahydrate) | ThermoFisher | M33 | |
| Tris Base | ThermoFisher | B152 | |
| Ferric chloride (hexahydrate) | ThermoFisher | I88 | |
| Trichloroacetic acid | ThermoFisher | A324 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | ThermoFisher | H330 | |
Adenosine 5’-diphosphate sodium salt |
Sigma Aldrich | A2754 | |
| Biomate III Spectrophotometer | ThermoFisher | 142982082 | Standard UV/Vis spectrophotometer |
References
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