酵素酢酸キナーゼのアセテート形成活性の直接検出
Summary
酢酸キナーゼ活性の測定方法について説明する。このアッセイは異なるホスホリルアクセプターで、酢酸を形成する方向に酢酸キナーゼの酵素活性と反応速度を決定するための直接的な反応を利用している。さらに、この方法は、酵素を利用する他のアセチルリン酸塩またはアセチル- CoAを検定するために利用することができます。
Abstract
酢酸キナーゼ、酢酸、砂糖キナーゼ- Hsp70の-アクチン（ASKHA）酵素のスーパーファミリー1-5のメンバーは、基質としてATPを利用したアセチルリン酸への酢酸の可逆的リン酸化を担当しています。酢酸キナーゼは、 古細菌の一属で見つかった、 細菌のユビキタスであり、またEukarya 6の微生物中に存在する。最もよく特徴付け酢酸キナーゼは、メタンガスを作り出す細菌Methanosarcinaサーモ 7月14日からということです。唯一のリン酸塩形成アセチル方向にATPない私を PPに利用できますが、酢酸キナーゼは、 赤痢アメーバ 、アメーバ赤痢の病原体から分離されており、これまでこの属15,16でのみ発見されました。
アセチルリン酸形成の方向では、酢酸キナーゼ活性は、通常、最初リップマンによって記述された、ヒドロキアッセイを用いて測定され17-20、ADPへのATPの変換が酵素のピルビン酸キナーゼ、乳酸脱水素酵素21,22、またはアセチルリン酸塩の製品との反応後の無機リン酸の放出を測定するアッセイによりNAD +にNADHの酸化に結合される結合アッセイヒドロキシルアミン23と。反対の活動は、酢酸を形成する方向は、ADPからNADPの還元+酵素のヘキソキナーゼとグルコース-6 -リン酸脱水素酵素24によりNADPHにするためにATPの形成を結合することによって測定されます。
ここでは、カップリング酵素を必要としない酢酸の形成の方向に酢酸キナーゼ活性を検出するための方法を説明しますが、代わりにアセチルリン酸の消費量の直接測定に基づいています。酵素反応の後、残りのアセチルリン酸塩は、ヒドロキアッセイ用として、分光光度法で測定することができる第二鉄ヒドロキ複合体に変換されます。このように、STとは異なり、ADPからATPの生産に依存しているこの方向のandard結合アッセイは、この直接的なアッセイは、ATPまたはPP iを生成する酢酸キナーゼのために使用することができます。
Protocol
このプロトコルの全体的なスキームを図1に概説されている。 1。標準曲線とアッセイのためのソリューションの準備ヒドロキシルアミン塩酸の2モル/ Lの溶液100 mLを準備します。ヒドロキシルアミン塩酸塩の13.9グラム（MW 69.49グラム/モル）を秤量し、約50 mLの蒸留-脱イオン水（のddH 2 O）に溶解する。水酸化カリウムペレットまたは濃縮液を用いてpHを7.0に…
Discussion
このアッセイにおけるアセチルリン酸の検出は、ヒドロキシルアミン塩酸塩と塩化第二鉄溶液の濃度と酸性度の十分な濃度に依存している。アッセイ体積の変化は、これらのコンポーネントの両方の見直しが必要になります。酵素反応は、ここで説明し、37℃60℃実行ヒドロキシル終端を持つC℃で5分間で行った。これより高い温度は、アセチルヒドロキに残っているアセチルリン酸塩の迅速?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、KSSのNSF賞＃0920274およびサウスカロライナ州試験場プロジェクト（SC – 1700340）によってサポートされていました。本論文では、クレムソン大学の試験場の技術的貢献番号5929です。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Acetyl phosphate | Sigma Aldrich | 01409 | Lithium Salt (97% ) |
| Sodium phosphate monobasic (dehydrate) | ThermoFisher | S381 | |
| Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | ThermoFisher | S374 | |
| Magnesium chloride (hexahydrate) | ThermoFisher | M33 | |
| Tris Base | ThermoFisher | B152 | |
| Ferric chloride (hexahydrate) | ThermoFisher | I88 | |
| Trichloroacetic acid | ThermoFisher | A324 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | ThermoFisher | H330 | |
Adenosine 5’-diphosphate sodium salt |
Sigma Aldrich | A2754 | |
| Biomate III Spectrophotometer | ThermoFisher | 142982082 | Standard UV/Vis spectrophotometer |
References
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Citer Cet Article
Fowler, M. L., Ingram-Smith, C. J., Smith, K. S. Direct Detection of the Acetate-forming Activity of the Enzyme Acetate Kinase. J. Vis. Exp. (58), e3474, doi:10.3791/3474 (2011).