Прямая Обнаружение ацетат формирования Деятельность киназы ацетат Фермент
Summary
Метод определения активности киназы ацетат описывается. Этот тест использует прямой реакции для определения активности ферментов и кинетики ацетат киназа в ацетат формирования направления с различными фосфорильной акцепторов. Кроме того, этот метод может быть использован для опробования других ацетил фосфата или ацетил-КоА использованием ферментов.
Abstract
Ацетат киназа, член ацетат киназа и сахар-Hsp70-актина (ASKHA) ферментов суперсемейства 1-5, несет ответственность за обратимое фосфорилирование ацетата в ацетил фосфат использования АТФ в качестве подложки. Ацетат киназа повсеместно распространены в бактерии, найденные в один род археи, а также присутствуют в микробы Eukarya 6. Наиболее хорошо охарактеризованы ацетат киназа является то, что от метанобразующих archaeon Methanosarcina thermophila 7-14. Ацетат киназа, которые могут только использовать PP я, но не СПС в направлении ацетил-фосфат формирования был изолирован от Entamoeba histolytica, возбудитель амебной дизентерии, и до сих пор только были найдены в этом роде 15,16.
В направлении ацетил формирование фосфат, ацетат киназа деятельности, как правило, измеряется с помощью гидроксамата анализа, впервые описанный Липмана17-20, связанной тест, в котором превращение АТФ в АДФ связан с окислением NADH в NAD + киназой ферментов пируват и лактат дегидрогеназы 21,22, или анализ измерений релиз неорганического фосфата после реакции ацетил продукта фосфат гидроксиламином 23. Деятельность в противоположном, ацетат формирования направлении измеряется связь образования АТФ из АДФ с сокращением НАДФ + до NADPH ферментами гексокиназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 24.
Здесь мы опишем метод обнаружения ацетат киназа деятельность в направлении ацетат образование, которое не требует связи ферментов, но вместо этого на основе прямого определения ацетил потребление фосфата. После ферментативной реакции, оставаясь ацетил фосфат превращается в комплекс железа гидроксамата который может быть измерен спектрофотометрически, как и для гидроксамата анализа. Таким образом, в отличие от улandard связан анализ на этом направлении, который зависит от производства АТФ из АДФ, это прямой анализ может быть использован для ацетат киназа, которые производят АТФ или PP я.
Protocol
Discussion
Обнаружение ацетил фосфатов в этом анализе, зависит от концентрации, достаточной гидрохлорида гидроксиламина и концентрацию и кислотность раствора хлорного железа. Внесение изменений в анализе объема потребует пересмотра этих двух компонентов. Ферментативные реакции, описанные зде…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NSF награду # 0920274 и Южной Каролине опытная станция проекта (SC-1700340) до KSS. Эта статья технический вклад номер 5929 от опытная станция Университет Клемсона.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Acetyl phosphate | Sigma Aldrich | 01409 | Lithium Salt (97% ) |
| Sodium phosphate monobasic (dehydrate) | ThermoFisher | S381 | |
| Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | ThermoFisher | S374 | |
| Magnesium chloride (hexahydrate) | ThermoFisher | M33 | |
| Tris Base | ThermoFisher | B152 | |
| Ferric chloride (hexahydrate) | ThermoFisher | I88 | |
| Trichloroacetic acid | ThermoFisher | A324 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | ThermoFisher | H330 | |
Adenosine 5’-diphosphate sodium salt |
Sigma Aldrich | A2754 | |
| Biomate III Spectrophotometer | ThermoFisher | 142982082 | Standard UV/Vis spectrophotometer |
References
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A. An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A. Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases. Protein Sci. 2, 31-40 (1993).
- Buss, K. A. Urkinase: structure of acetate kinase, a member of the ASKHA superfamily of phosphotransferases. J. Bacteriol. 183, 680-686 (2001).
- Hurley, J. H. The sugar kinase/heat shock protein 70/actin superfamily: implications of conserved structure for mechanism. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 137-162 (1996).
- Holmes, K. C., Sander, C., Valencia, A. A new ATP-binding fold in actin, hexokinase and Hsc70. Trends. Cell. Biol. 3, 53-59 (1993).
- Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. Acetate kinase: not just a bacterial enzyme. Trends. Microbiol. 14, 249-253 (2006).
- Aceti, D. J., Ferry, J. G. Purification and characterization of acetate kinase from acetate-grown Methanosarcina thermophila. Evidence for regulation of synthesis. J. Biol. Chem. 263, 15444-15448 (1988).
- Latimer, M. T., Ferry, J. G. Cloning, sequence analysis, and hyperexpression of the genes encoding phosphotransacetylase and acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Bacteriol. 175, 6822-6829 (1993).
- Ingram-Smith, C., Barber, R. D., Ferry, J. G. The role of histidines in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 275, 33765-33770 (2000).
- Miles, R. D., Iyer, P. P., Ferry, J. G. Site-directed mutational analysis of active site residues in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 276, 45059-45064 (2001).
- Miles, R. D., Gorrell, A., Ferry, J. G. Evidence for a transition state analog, MgADP-aluminum fluoride-acetate, in acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 277, 22547-22552 (2002).
- Ingram-Smith, C. Characterization of the acetate binding pocket in the Methanosarcina thermophila acetate kinase. J. Bacteriol. 187, 2386-2394 (2005).
- Gorrell, A., Lawrence, S. H., Ferry, J. G. Structural and kinetic analyses of arginine residues in the active site of the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 280, 10731-10742 (2005).
- Gorrell, A., Ferry, J. G. Investigation of the Methanosarcina thermophila acetate kinase mechanism by fluorescence quenching. Biochimie. 46, 14170-14176 (2007).
- Reeves, R. E., Guthrie, J. D. Acetate kinase (pyrophosphate). A fourth pyrophosphate-dependent kinase from Entamoeba histolytica. Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1389-1395 (1975).
- Fowler, M. L. Kinetic and structural characterization of the novel PPi-dependent acetate kinase from the parasite Entamoeba histolytica. , (2011).
- Lipmann, F. Enzymatic synthesis of acetyl phosphate. J. Biol. Chem. 155, 55-70 (1944).
- Lipmann, F., Tuttle, L. C. A specific micromethod for determination of acyl phosphates. J. Biol. Chem. 159, 21-28 (1945).
- Lipmann, F., Jones, M. E., Black, S., Flynn, R. M. The mechanism of the ATP-CoA-acetate reaction. J. Cell. Physiol. Suppl. 41, 109-112 (1953).
- Rose, I. A., Grunberg-Manago, M., Korey, S. F., Ochoa, S. Enzymatic phosphorylation of acetate. J. Biol. Chem. 211, 737-756 (1954).
- Allen, S. H., Kellermeyer, R. W., Stjernholm, R. L., Wood, H. G. Purification and properties of enzymes involved in the proponic acid fermentation. Journal of Bacteriology. 87, 171-187 (1964).
- Clarke, P. M., Payton, M. A. An enzymatic assay for acetate in spent bacterial culture supernatants. Anal. Biochem. 130, 402-405 (1983).
- Mukhopadhyay, S., Hasson, M. S., Sanders, D. A. A continuous assay of acetate kinase activity: measurement of inorganic phosphate release generated by hydroxylaminolysis of acetyl phosphate. Bioorg. Chem. 36, 65-69 (2008).
- Nakajima, H., Suzuki, K., Imahori, K. Purification and properties of acetate kinase from Bacillus stearothermophilus. J. Biochem. 84, 193-203 (1978).
