Un método para la determinación de la actividad quinasa de acetato se describe. Este ensayo utiliza una reacción directa para determinar la actividad enzimática y la cinética de la cinasa de acetato en la dirección de acetato de formación con diferentes aceptores fosforilo. Además, este método puede ser utilizado para el ensayo de fosfato de otros o acetil de acetil-CoA utilizando enzimas.
Quinasa de acetato, un miembro del acetato y el azúcar-quinasa Hsp70-actina (ASKHA) superfamilia de enzimas 1-5, es el responsable de la fosforilación reversible de acetato de acetil fosfato que utilizan ATP como sustrato. Acetato de quinasas son muy abundantes en las bacterias, que se encuentra en un género de Archaea, y también están presentes en los microbios de la Eukarya 6. El acetato quinasa mejor caracterizados es que a partir del metano que producen thermophila archaeon Methanosarcina 14.07. Una quinasa acetato de que sólo se puede utilizar PP i ATP, pero no en la dirección de la acetil-fosfato forman se ha aislado de Entamoeba histolytica, el agente causante de la disentería amebiana, y hasta el momento sólo se han encontrado en este género 15,16.
En la dirección de la formación de acetil fosfato, acetato de actividad quinasa se mide típicamente usando el ensayo de hidroxamato, describió por primera vez por Lipmann17-20, un ensayo acoplado en lo que se suma la conversión de ATP a ADP a la oxidación de NADH a NAD + por la piruvato quinasa enzimas lactato deshidrogenasa y 21,22, o un ensayo de medición de la liberación de fosfato inorgánico después de la reacción del producto acetil fosfato con hidroxilamina 23. Actividad en la dirección opuesta, el acetato de formación de la dirección se mide mediante el acoplamiento de la formación de ATP a partir de ADP a la reducción de NADP + a NADPH por las enzimas hexoquinasa y glucosa 6-fosfato deshidrogenasa 24.
Aquí se describe un método para la detección de la actividad quinasa de acetato en la dirección de la formación de acetato que no requiere de enzimas de acoplamiento, sino que se basa en la determinación directa del consumo de acetil fosfato. Después de la reacción enzimática, fosfato restante acetil se convierte en un complejo hidroxamato férrico que se puede medir espectrofotométricamente, como para el ensayo de hidroxamato. Por lo tanto, a diferencia del stensayo andard junto a esta dirección, que depende de la producción de ATP a partir de ADP, este ensayo directo se pueden utilizar para las quinasas de acetato que producen ATP o PP i.
La detección de acetil fosfato en este ensayo depende de una suficiente concentración de clorhidrato de hidroxilamina y la concentración y la acidez de la solución de cloruro férrico. Alteración del volumen de ensayo requiere la reconsideración de estos dos componentes. Las reacciones enzimáticas que se describe aquí se realizaron a 37 ° C con la terminación hidroxilamina realiza a 60 ° C durante 5 minutos. Esta temperatura más alta es fundamental para permitir la rápida transformación de la acetil fosfat…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el premio NSF # 0920274 y Carolina del Sur de la Estación Experimental del proyecto (SC-1700340) para KSS. Este documento es el N º 5929 Contribución Técnica de la Estación Experimental de la Universidad de Clemson.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Acetyl phosphate | Sigma Aldrich | 01409 | Lithium Salt (97% ) |
Sodium phosphate monobasic (dehydrate) | ThermoFisher | S381 | |
Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | ThermoFisher | S374 | |
Magnesium chloride (hexahydrate) | ThermoFisher | M33 | |
Tris Base | ThermoFisher | B152 | |
Ferric chloride (hexahydrate) | ThermoFisher | I88 | |
Trichloroacetic acid | ThermoFisher | A324 | |
Hydroxylamine hydrochloride | ThermoFisher | H330 | |
Adenosine 5’-diphosphate sodium salt |
Sigma Aldrich | A2754 | |
Biomate III Spectrophotometer | ThermoFisher | 142982082 | Standard UV/Vis spectrophotometer |