En metode for bestemmelse av acetat kinase aktivitet er beskrevet. Denne analysen benytter en direkte reaksjon for å bestemme enzymaktivitet og kinetikk av acetat kinase i acetat-forming retning med forskjellige phosphoryl akseptorer. Videre kan denne metoden benyttes for analysere andre acetyl fosfat eller acetyl-CoA utnytte enzymer.
Acetat kinase, et medlem av acetat og sukker kinase-Hsp70-aktin (ASKHA) enzym superfamily 1-5, er ansvarlig for reversibel fosforylering av acetate til acetyl fosfat utnytte ATP som substrat. Acetat kinaser er allestedsnærværende i Bakterier, som finnes i en slekt av Archaea, og er også til stede i mikrober av Eukarya 6. Den mest godt karakterisert acetate kinase er at fra metan-produserende archaeon Methanosarcina thermophila 7-14. En acetate kinase som bare kan benytte PP jeg, men ikke ATP i acetyl fosfat-forming retning har vært isolert fra Entamoeba histolytica, den forårsaker agent for amøbedysenteri, og har så langt bare blitt funnet i denne slekten 15,16.
I retning av acetyl fosfat formasjonen, er acetate kinase aktivitet vanligvis målt ved hjelp av hydroxamate analysen, først beskrevet av Lipmann17-20, en kombinert analyse hvor konvertering av ATP til ADP er koblet til oksidasjon av NADH til NAD + av enzymene pyruvat kinase og laktat dehydrogenase 21,22, eller en analyse som måler utslipp av uorganisk fosfat etter reaksjonen til acetyl fosfat produktet med hydroksylamin 23. Aktiviteten i det motsatte, er acetate-forming retning målt ved kopling ATP dannelse fra ADP til reduksjon av NADP + til NADPH av enzymer hexokinase og glukose 6-fosfat dehydrogenase 24.
Her beskriver vi en metode for påvisning av acetat kinase aktivitet i retning av acetat formasjon som ikke krever kopling enzymer, men er i stedet basert på direkte fastsettelse av acetyl fosfat forbruk. Etter enzymatisk reaksjon, er gjenværende acetyl fosfat omdannes til en Ferric hydroxamate kompleks som kan måles spektrofotometrisk, som for hydroxamate analysen. Derfor, i motsetning til standard kombinert analysen for denne retningen er avhengig av produksjon av ATP fra ADP, kan dette direkte analysen brukes for acetate kinaser som produserer ATP eller PP jeg.
Påvisning av acetyl fosfat i denne analysen er avhengig av en tilstrekkelig konsentrasjon av hydroksylamin hydroklorid og konsentrasjon og surhet av Ferric klorid løsningen. Endring av analysen volum vil kreve ny vurdering av begge disse komponentene. Den enzymatiske reaksjoner som beskrives her ble utført ved 37 ° C med hydroksylamin oppsigelse utført ved 60 ° C i 5 minutter. Dette høyere temperatur er avgjørende for å tillate rask konvertering av de resterende acetyl fosfat til acetyl hydroxamate. Tidspunktet…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NSF award # 0920274 og South Carolina Experiment Station Project (SC-1700340) til KSS. Dette papiret er tekniske bidrag nr. 5929 av Clemson University Experiment Station.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Acetyl phosphate | Sigma Aldrich | 01409 | Lithium Salt (97% ) |
Sodium phosphate monobasic (dehydrate) | ThermoFisher | S381 | |
Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | ThermoFisher | S374 | |
Magnesium chloride (hexahydrate) | ThermoFisher | M33 | |
Tris Base | ThermoFisher | B152 | |
Ferric chloride (hexahydrate) | ThermoFisher | I88 | |
Trichloroacetic acid | ThermoFisher | A324 | |
Hydroxylamine hydrochloride | ThermoFisher | H330 | |
Adenosine 5’-diphosphate sodium salt |
Sigma Aldrich | A2754 | |
Biomate III Spectrophotometer | ThermoFisher | 142982082 | Standard UV/Vis spectrophotometer |