Kartlegging Molekylær Diffusion i plasmamembranen ved Multiple-Target Tracing (MTT)
Summary
Multiple-Target Tracing er en hjemmelaget algoritme utviklet for sporing individuelt merket molekyler i plasma membran av levende celler. Effektiv oppdage, estimering og sporing molekyler over tid ved høy tetthet gir et brukervennlig, omfattende verktøy for å undersøke nanoskala membran dynamikk.
Abstract
Vårt mål er å oppnå en omfattende beskrivelse av molekylære prosesser skjer på cellemembraner i forskjellige biologiske funksjoner. Vi tar sikte på å karakterisere kompleks organisasjon, og dynamikken i plasmamembranen ved enkelt-molekyl nivå, ved å utvikle analytiske verktøy som er spesielt Single-Particle Tracking (SPT) ved høy tetthet: Multiple-Target Tracing (MTT) 1. Single-molekyl videomicroscopy, tilbyr millisekund og nanometric oppløsning 1-11, gir en detaljert fremstilling av membran organisasjon 12-14 av nøyaktig kartlegging deskriptorer som celle reseptorer lokalisering, mobilitet, innesperring eller interaksjoner.
Vi revisited SPT, både eksperimentelt og algoritmer. Eksperimentelle aspekter inkluderte optimalisere oppsett og celle merking, med særlig vekt på å nå høyest mulig merking tetthet, for å gi en dynamisk øyeblikksbilde av molekylære dynamikk ens det skjer innenfor membranen. Algoritmiske problemer bekymret hvert trinn brukes til ombygging baner: topper deteksjon, estimering og gjenkjenning, løses ved spesifikke verktøy fra bildeanalyse 15,16. Implementering deflasjon etter påvisning lar redde topper opprinnelig skjult av nabolandene, sterkere topper. Av notatet, bedre deteksjon påvirker direkte oppkobling, ved å redusere gap innen baner. Forestillinger har blitt evaluert ved hjelp av Monte-Carlo simuleringer for ulike merking tetthet og støy verdier, som typisk representerer de to store begrensninger for parallelle målinger ved høy spatiotemporal oppløsning.
Den nanometric nøyaktighet 17 innhentet for enkle molekyler, enten ved hjelp påfølgende on / off photoswitching eller ikke-lineær optikk, kan levere grundige observasjoner. Dette er grunnlaget for nanoscopy metoder 17 som 18 STORM, PALM 19,20, RESOLFT 21 eller Sted 22,23, WHIch kan ofte kreve bildebehandlingsprogrammer faste prøver. Den sentrale oppgave er å oppdage og estimering av diffraksjon-begrensede topper kommer fra single-molekyler. Derfor gir tilstrekkelige forutsetninger for eksempel håndtering av en konstant posisjonelle nøyaktighet i stedet for Brownske bevegelser, er MTT oversiktlig egnet for nanoscopic analyser. Videre kan MTT fundamentalt brukes til enhver skala: ikke bare for molekyler, men også for celler eller dyr, for eksempel. Derfor er MTT en kraftig sporing algoritme som finner programmer på molekylære og cellulære skalaer.
Protocol
Discussion
I single-partikkel sporing, ved siden av cellen og mikroskopi aspekter, representerer analysen en vesentlig del av arbeidet. Dette løser algoritmen som brukes til å utføre de tre hovedoppgaver: å oppdage, estimering og koble topper over hver ramme. Men påfølgende del av dette arbeidet ligger i å utarbeide algoritmen selv, som kanskje må være tilrettelagt for eventuell ny dedikert etterforskning, i hovedsak for de siste, ekstra trinn (for eksempel tyde moduser bevegelse, interaksjoner eller støkiometri).
<p…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmene av teamet vårt, særlig MC Blaché for teknisk assistanse, samt M Irla og B Imhof, for deres støtte og fruktbare diskusjoner. Tall for deflasjon og innesperring reprodusert courtesy of Nature Methods. Dette prosjektet er støttet av institusjonelle tilskudd fra CNRS og INSERM og Marseille universitet, og ved spesielle tilskudd fra regionen Provence-Alpes-Côte-d'Azur, Institut National du Cancer, Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-PCVI- 0034-02, 2010 ANR BLAN 1214 01) og Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR er støttet av et fellesskap fra Ligue Nationale Contre le Cancer.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Quantity |
| Cos-7 cell line | ATCC | CRL-1651 | 5,000 cells/well |
| HBSS without Ca2+ | GIBCO | 14175 | 1 ml |
| 0.05% Trypsin EDTA | GIBCO | 25300 | 1 ml |
| 8-well Lab-tek | NUNC | 155441 | 1 |
| QDot-605 streptavidin | Invitrogen | Q10101MP | 20 mM |
| Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21) | |||
| Fab from mAb 108 | ATCC | HB-9764 | 200 μg |
| NHS-Biotin | Thermo Scientific | 21435 | 18.5 μg |
| Complete medium | |||
| DMEM | GIBCO | 41965 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | 50 ml |
| L-Glutamine | GIBCO | 25030 | 5 ml |
| HEPES | GIBCO | 15630 | 5 ml |
| Sodium Pyruvate | GIBCO | 11360 | 5 ml |
| Imaging medium | |||
| HBSS with Ca2+ | GIBCO | 14025 | 25 ml |
| HEPES | GIBCO | 15630 | 250 μl |
| Equipment | Company | Reference |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000U |
| Fluorescent lamp | Nikon | Intensilight C-HGFIE |
| 1.3 NA 100x objective | Nikon | Plan Fluor 1.30 |
| 1.49 NA 100x objective | Nikon | APO TIRF 1.49 |
| Camera | Roper Scientific | Cascade 512 B |
| Thermostated box | Life Imaging Services | The Box |
Appendix: example Script of MTT supplementary analysis
function MTT_example(file_name)
%%% Basic examples showing how to recover MTT output results
%%% to plot each trace and to build the histogram
%%% of fluorescence intensities
if nargin<1 % no file_name provided?
files = dir(‘*.stk’);
if isempty(files), disp(‘no data in current dir’), return, end
file_name = files(1).name; % default: first stk file
disp([‘using’ file_name ‘by default’])
end
file_param = [file_name ‘_tab_param.dat’]; % output file
%% Load data
cd(‘output23′) % or (‘output22’), according to version used
% Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters,
% an extra parameter, noise, was added in version 2.3
% To read all parameters at once, in a single table
% tab_param = fread_all_param(file_param);
% tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = …
% To read all parameters (except frame_number) in separate tables
% [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param);
tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded!
tab_j= fread_data_spt(file_param, 4);
tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5);
tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8);
%% Loop over traces
N_traces = size(tab_i,1);
% Tables are N_traces lines by N_frames colums
for itrc = 1:N_traces
No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only
plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index))
xlabel(‘i (pixel)’), ylabel(‘j (pixel)’)
title([‘trace # ‘ num2str(itrc)])
disp(‘Please strike any key for next trace’), pause
end
%% Fluo histogram
N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only
hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins
xlabel(‘intensity (a.u.)’), ylabel(‘occurrence’)
title(‘histogram of particles fluorescence intensity’)
References
- Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat. Methods. 5, 687-694 (2008).
- Schmidt, T., Schutz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H. Imaging of single molecule diffusion. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93, 2926-2929 (1996).
- Lommerse, P. H. Single-molecule imaging of the H-ras membrane-anchor reveals domains in the cytoplasmic leaflet of the cell membrane. Biophys. J. 86, 609-616 (2004).
- Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order. EMBO. J. 25, 3446-3457 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: applications to membrane dynamics. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 373-399 (1997).
- Dahan, M. Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single-quantum dot tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
- Harms, G. S. Single-molecule imaging of l-type Ca(2+) channels in live cells. Biophys. J. 81, 2639-2646 (2001).
- Iino, R., Koyama, I., Kusumi, A. Single molecule imaging of green fluorescent proteins in living cells: E-cadherin forms oligomers on the free cell surface. Biophys. J. 80, 2667-2677 (2001).
- Sako, Y., Minoghchi, S., Yanagida, T. Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living cells. Nat. Cell Biol. 2, 168-172 (2000).
- Schutz, G. J., Kada, G., Pastushenko, V. P., Schindler, H. Properties of lipid microdomains in a muscle cell membrane visualized by single molecule microscopy. Embo. J. 19, 892-901 (2000).
- Seisenberger, G. Real-time single-molecule imaging of the infection pathway of an adeno-associated virus. Science. 294, 1929-1932 (2001).
- Jacobson, K., Sheets, E. D., Simson, R. Revisiting the fluid mosaic model of membranes. Science. 268, 1441-1442 (1995).
- Saffman, P. G., Delbruck, M. Brownian motion in biological membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 72, 3111-3113 (1975).
- Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
- Papoulis, A. . Probability, Random Variables and Stochastic Process 277. , (2001).
- Van Trees, H. L. . Detection, Estimation, and Modulation Theory, Wiley Inter-Science. , (1968).
- Moerner, W. E. Single-molecule mountains yield nanoscale cell images. Nat. Methods. 3, 781-782 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).
- Betzig, E. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Manley, S. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).
- Andrew, S. M. Enzymatic digestion of monoclonal antibodies. Methods Mol. Med. 40, 325-331 (2000).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt. Lett. 19, 780-782 (1994).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24, 954-956 (1999).
- Meilhac, N., Guyader, L. L. e., Salome, L., Destainville, N. Detection of confinement and jumps in single-molecule membrane trajectories. Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft. Matter Phys. 73, 011915 (2006).
- Saxton, M. J. Single-particle tracking: effects of corrals. Biophys. J. 69, 389-398 (1995).
- Serge, A., Fourgeaud, L., Hemar, A., Choquet, D. Receptor activation and homer differentially control the lateral mobility of metabotropic glutamate receptor 5 in the neuronal membrane. J. Neurosci. 22, 3910-3920 (2002).
- Simson, R., Sheets, E. D., Jacobson, K. Detection of temporary lateral confinement of membrane proteins using single-particle tracking analysis. Biophys. J. 69, 989-993 (1995).
- Jacobson, K., Dietrich, C. Looking at lipid rafts. Trends Cell Biol. 9, 87-91 (1999).
- Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophys. J. 65, 2021-2040 (1993).
- Livneh, E. Large deletions in the cytoplasmic kinase domain of the epidermal growth factor receptor do not affect its laternal mobility. J. Cell Biol. 103, 327-331 (1986).
- Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and. 4, 435-446 (2005).
- Wu, X., Bruchez, M. P. Labeling cellular targets with semiconductor quantum dot conjugates. Methods Cell Biol. 75, 171-183 (2004).
- Mohammadi, M. Aggregation-induced activation of the epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase. Biochimie. 32, 8742-8748 (1993).
- Howarth, M. Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells. Nat. Methods. 5, 397-399 (2008).
- Bertaux, N., Marguet, D., Rigneault, H., Sergé, A. Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface. Protocol Exchange. , (1038).
- Groc, L. Surface trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 12433-12437 (2007).
- Cui, B. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
- He, H. T., Marguet, D. Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 417-436 (2011).
- Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J. Cell. Sci. 123, 309-320 (2010).
- Kao, H. P., Verkman, A. S. Tracking of single fluorescent particles in three dimensions: use of cylindrical optics to encode particle position. Biophys. J. 67, 1291-1300 (1994).
