Mapeamento de Difusão Molecular na membrana plasmática por Multiple-Target Tracing (MTT)

Summary

Multiple-alvo é um algoritmo de rastreio caseiro desenvolvido para controlar individualmente moléculas marcadas no interior da membrana plasmática de células vivas. Detecção eficaz de, estimar e rastreamento de moléculas ao longo do tempo a alta densidade de fornecer uma ferramenta de fácil utilização, abrangente para investigar a dinâmica da membrana em nanoescala.

Abstract

Nosso objetivo é obter uma descrição detalhada dos processos moleculares que ocorrem em membranas celulares em diferentes funções biológicas. Temos o objetivo de caracterizar a organização complexa e dinâmica da membrana plasmática a nível molécula única, através do desenvolvimento de ferramentas analíticas dedicadas a uma única partícula Tracking (SPT) em alta densidade: Multiple-Target de rastreamento (MTT) ^1. Uma única molécula de videomicroscopia, oferecendo milissegundo e nanométrica resolução ^1-11, permite uma representação detalhada da organização da membrana ^12-14 com precisão o mapeamento descritores, tais como receptores de células de localização, mobilidade confinamento, ou interações.

Nós revisitado SPT, tanto experimentalmente e através de algoritmos. Aspectos experimentais incluíram optimizar a instalação ea marcação celular, com um ênfase particular ao atingir a densidade de rotulagem mais alta possível, a fim de proporcionar um instantâneo dinâmico de um dinâmica moleculars que ocorre no interior da membrana. Questões algorítmicas preocupado cada passo usado para a reconstrução trajetórias: a detecção de picos, a estimativa e religação, dirigida por ferramentas específicas de análise de imagem ^15,16. Implementar deflação após a detecção permite picos de resgate inicialmente oculta por vizinhos, os picos mais fortes. De nota, melhorando a detecção impacta diretamente a reconexão, reduzindo as lacunas dentro de trajetórias. Performances foram avaliados através de simulações de Monte Carlo para a densidade de rotulagem e vários valores de ruído, que normalmente representam as duas grandes limitações para medições paralelas na resolução espaço-temporal alta.

A precisão nanométrica ¹⁷ obtido para moléculas individuais, utilizando quer sucessiva de ligar / desligar óptica photoswitching ou não-linear, pode fornecer observações exaustivos. Esta é a base de métodos Nanoscopia ¹⁷ como STORM ^18, PALM ^{19,20, 21} ou RESOLFT STED ^22,23, whiCH podem muitas vezes exigem amostras de imagens fixas. A tarefa central é a detecção e estimativa de difração limitada picos que emanam de um único moléculas. Assim, fornecendo pressupostos adequados, tais como lidar com uma precisão posicional constante em vez do movimento browniano, MTT é diretamente adequado para análises nanoscópicas. Além disso, o MTT pode fundamentalmente ser utilizado em qualquer escala: não só para as moléculas, mas também para células ou animais, por exemplo. Assim, o MTT é um algoritmo de seguimento poderoso que encontra aplicações em escalas moleculares e celulares.

Protocol

Neste vídeo, apresentamos um experimento de acompanhamento integral única partícula, usando-pontos quânticos direcionados para um receptor de membrana específico. O principal objectivo desta experiência consiste em discriminar diferentes tipos de comportamentos difusão molecular medidos no interior da membrana plasmática de células vivas. Com efeito, os movimentos moleculares resultantes na membrana pode desviar-se tipicamente de difusão Browniano sendo linearmente dirigida ou confinada dentro nanodomains <sup…

Discussion

Em uma única partícula de rastreamento, ao lado dos aspectos de células e microscopia, a análise representa uma parte substancial do trabalho. Isso resolve o algoritmo usado para executar as três tarefas principais: detectar, estimando-se e reconectando picos em cada frame. Mas o aspecto conseqüente deste trabalho reside na elaboração do algoritmo em si, que podem precisar ser adaptado para qualquer nova investigação dedicada, essencialmente, para os últimos, os passos extras (como decifrar os modos de movime…

Materials

Reagent	Company	Catalogue number	Quantity
Cos-7 cell line	ATCC	CRL-1651	5,000 cells/well
HBSS without Ca2+	GIBCO	14175	1 ml
0.05% Trypsin EDTA	GIBCO	25300	1 ml
8-well Lab-tek	NUNC	155441	1
QDot-605 streptavidin	Invitrogen	Q10101MP	20 mM
Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21)
Fab from mAb 108	ATCC	HB-9764	200 μg
NHS-Biotin	Thermo Scientific	21435	18.5 μg
Complete medium
DMEM	GIBCO	41965	500 ml
Fetal Bovine Serum	SIGMA	F7524	50 ml
L-Glutamine	GIBCO	25030	5 ml
HEPES	GIBCO	15630	5 ml
Sodium Pyruvate	GIBCO	11360	5 ml
Imaging medium
HBSS with Ca2+	GIBCO	14025	25 ml
HEPES	GIBCO	15630	250 μl

 

Equipment	Company	Reference
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TE2000U
Fluorescent lamp	Nikon	Intensilight C-HGFIE
1.3 NA 100x objective	Nikon	Plan Fluor 1.30
1.49 NA 100x objective	Nikon	APO TIRF 1.49
Camera	Roper Scientific	Cascade 512 B
Thermostated box	Life Imaging Services	The Box

Appendix: example Script of MTT supplementary analysis

function MTT_example(file_name)
%%% Basic examples showing how to recover MTT output results
%%% to plot each trace and to build the histogram
%%% of fluorescence intensities

if nargin<1 % no file_name provided?
    files = dir(‘*.stk’);
    if isempty(files), disp(‘no data in current dir’), return, end
    file_name = files(1).name; % default: first stk file
    disp([‘using’ file_name ‘by default’])
end

file_param = [file_name ‘_tab_param.dat’]; % output file

%% Load data
cd(‘output23′) % or (‘output22’), according to version used
% Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters,
% an extra parameter, noise, was added in version 2.3

% To read all parameters at once, in a single table
% tab_param = fread_all_param(file_param);
% tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = …

% To read all parameters (except frame_number) in separate tables
% [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param);

tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded!
tab_j= fread_data_spt(file_param, 4);
tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5);
tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8);

%% Loop over traces
N_traces = size(tab_i,1);
% Tables are N_traces lines by N_frames colums

for itrc = 1:N_traces
    No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only
     plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index))
    xlabel(‘i (pixel)’), ylabel(‘j (pixel)’)
    title([‘trace # ‘ num2str(itrc)])
    disp(‘Please strike any key for next trace’), pause
end

%% Fluo histogram
N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only
hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins
xlabel(‘intensity (a.u.)’), ylabel(‘occurrence’)
title(‘histogram of particles fluorescence intensity’)