Cartografía de la difusión molecular en la membrana plasmática de objetivos múltiples de Búsquedas (MTT)

Summary

Objetivos múltiples de seguimiento es un algoritmo desarrollado para el seguimiento de fabricación casera individualmente moléculas marcadas dentro de la membrana plasmática de las células vivas. De manera eficiente la detección, la estimación y el seguimiento de las moléculas a través del tiempo en la alta densidad proporcionan un fácil de usar, herramienta completa para investigar la dinámica de la membrana a nanoescala.

Abstract

Nuestro objetivo es obtener una descripción completa de los procesos moleculares que ocurren en las membranas celulares de diferentes funciones biológicas. Nuestro objetivo es la caracterización de la organización compleja y dinámica de la membrana plasmática en una sola molécula de nivel, mediante el desarrollo de herramientas analíticas dedicadas a una sola partícula de seguimiento (SPT) en alta densidad: Múltiples-Objetivo de Búsquedas (MTT) ^1. Una sola molécula de videomicroscopía, ofreciendo milisegundos y resolución nanométrica ^1-11, permite una representación detallada de la organización de la membrana ^12-14 con precisión la cartografía descriptores tales como la localización de los receptores de la célula, la movilidad, el parto o interacciones.

Volvimos a visitar el SPT, tanto a nivel experimental y algorítmicamente. Aspectos experimentales incluyeron la optimización de la configuración y el etiquetado de células, con un énfasis particular en alcanzar la densidad de etiquetado más alto posible, a fin de proporcionar una instantánea dinámica de una dinámica moleculars que se produce dentro de la membrana. Problemas algorítmicos en cuestión cada paso utilizado para la reconstrucción de las trayectorias: la detección de picos, la estimación y la reconexión, se dirigió a las herramientas específicas de análisis de imagen ^15,16. Implementación de la deflación después de la detección permite que los picos rescate oculto inicialmente por los picos vecinos, más fuertes. Es de destacar que la mejora de la detección de un impacto directo en la reconexión, por la reducción de las diferencias dentro de las trayectorias. Las presentaciones han sido evaluadas utilizando simulaciones de Monte Carlo para la densidad de etiquetado diferentes y los valores de ruido, que normalmente representan las dos principales limitaciones de las mediciones paralelas con una resolución espacial y temporal de alta.

La precisión nanométrica ¹⁷ obtenido por moléculas individuales, usando ya sea sucesiva de encendido / apagado óptica photoswitching o no lineal, puede entregar observaciones exhaustivas. Esta es la base de los métodos de Nanoscopia ¹⁷ como TORMENTA ^18, PALM ^{19,20, 21} o RESOLFT STED ^22,23, WHICH menudo pueden requerir muestras de imágenes fijas. La tarea principal es la detección y estimación de los escasos picos de difracción que emanan de una sola molécula. Por lo tanto, proporcionar las hipótesis adecuadas, tales como el manejo de una precisión de posicionamiento constante en lugar del movimiento browniano, el MTT es francamente adecuado para el análisis de nanoscópicos. Además, MTT fundamentalmente se puede utilizar en cualquier escala: no sólo para las moléculas, sino también para las células o animales, por ejemplo. Por lo tanto, MTT es un algoritmo de seguimiento de gran alcance que tiene aplicaciones a escala molecular y celular.

Protocol

En este video, se presenta un solo experimento completo rastreo de partículas, utilizando los puntos cuánticos dirigidos a un receptor de membrana específico. El objetivo principal de este experimento consiste en la discriminación de los diferentes tipos de comportamientos de la difusión molecular de medición dentro de la membrana plasmática de las células vivas. En efecto, los movimientos moleculares que surgen en la membrana típicamente puede desviarse de difusión browniano al ser linealmente dirigido o conf…

Discussion

En una sola partícula de seguimiento, junto a los aspectos celulares y microscopía, el análisis representa una parte sustancial de la obra. Esto se dirige el algoritmo utilizado para realizar las tres tareas principales: la detección, la estimación y volver a conectar picos de más de cada fotograma. Pero el aspecto consecuente de este trabajo reside en la elaboración del propio algoritmo, que puede ser necesario adaptar a cualquier nueva investigación dedicada, fundamentalmente por los últimos pasos, extra (com…

Materials

Reagent	Company	Catalogue number	Quantity
Cos-7 cell line	ATCC	CRL-1651	5,000 cells/well
HBSS without Ca2+	GIBCO	14175	1 ml
0.05% Trypsin EDTA	GIBCO	25300	1 ml
8-well Lab-tek	NUNC	155441	1
QDot-605 streptavidin	Invitrogen	Q10101MP	20 mM
Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21)
Fab from mAb 108	ATCC	HB-9764	200 μg
NHS-Biotin	Thermo Scientific	21435	18.5 μg
Complete medium
DMEM	GIBCO	41965	500 ml
Fetal Bovine Serum	SIGMA	F7524	50 ml
L-Glutamine	GIBCO	25030	5 ml
HEPES	GIBCO	15630	5 ml
Sodium Pyruvate	GIBCO	11360	5 ml
Imaging medium
HBSS with Ca2+	GIBCO	14025	25 ml
HEPES	GIBCO	15630	250 μl

 

Equipment	Company	Reference
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TE2000U
Fluorescent lamp	Nikon	Intensilight C-HGFIE
1.3 NA 100x objective	Nikon	Plan Fluor 1.30
1.49 NA 100x objective	Nikon	APO TIRF 1.49
Camera	Roper Scientific	Cascade 512 B
Thermostated box	Life Imaging Services	The Box

Appendix: example Script of MTT supplementary analysis

function MTT_example(file_name)
%%% Basic examples showing how to recover MTT output results
%%% to plot each trace and to build the histogram
%%% of fluorescence intensities

if nargin<1 % no file_name provided?
    files = dir(‘*.stk’);
    if isempty(files), disp(‘no data in current dir’), return, end
    file_name = files(1).name; % default: first stk file
    disp([‘using’ file_name ‘by default’])
end

file_param = [file_name ‘_tab_param.dat’]; % output file

%% Load data
cd(‘output23′) % or (‘output22’), according to version used
% Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters,
% an extra parameter, noise, was added in version 2.3

% To read all parameters at once, in a single table
% tab_param = fread_all_param(file_param);
% tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = …

% To read all parameters (except frame_number) in separate tables
% [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param);

tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded!
tab_j= fread_data_spt(file_param, 4);
tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5);
tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8);

%% Loop over traces
N_traces = size(tab_i,1);
% Tables are N_traces lines by N_frames colums

for itrc = 1:N_traces
    No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only
     plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index))
    xlabel(‘i (pixel)’), ylabel(‘j (pixel)’)
    title([‘trace # ‘ num2str(itrc)])
    disp(‘Please strike any key for next trace’), pause
end

%% Fluo histogram
N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only
hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins
xlabel(‘intensity (a.u.)’), ylabel(‘occurrence’)
title(‘histogram of particles fluorescence intensity’)