다중 타겟 추적 (MTT)에 의해 플라즈마 막의 분자 확산을 매핑

Summary

다중 표적 추적은 살아있는 세포의 플라즈마 멤브레인 내에 개별적으로 분류된 분자를 추적용으로 개발된 수제 알고리즘입니다. 효율적으로 검출 nanoscale 멤브레인 역학을 조사하기 위해 사용자 친화적인, 포괄적인 도구를 제공하는 고밀도에서 시간에 따른 분자를 추정하고 추적.

Abstract

우리의 목표는 서로 다른 생물 학적 기능에 세포의 세포막에서 발생하는 분자 공정의 포괄적인 설명을 얻을 것입니다. 다중 타겟 추적 (MTT) ¹ : 우리는 고밀도로 단일 입자 추적 (SPT) 전용 분석 도구를 개발하여, 단일 분자 수준에서 복잡한 조직 및 플라즈마 막의 역학을 특성화 목표로하고 있습니다. 밀리초 및 nanometric 해상도 ^1-11을 제공하는 단일 분자 videomicroscopy은 정확하게 같은 세포 수용체의 현지화, 이동성, 감금이나 상호 작용과 같은 설명을 매핑하여 멤브레인 조직 ^12-14에 대한 상세한 표현이 가능합니다.

우리는 모두 실험적 및 algorithmically, SPT를 revisited. 실험적 측면 분자 역학 동적 스냅샷을 제공하기 위해, 최대한 라벨 밀도에 도달 특정 중심으로, 설치 및 셀 라벨을 최적화 포함의 그것은 멤브레인 내에 발생합니다. 봉우리 감지, 평가 및 재연결, 이미지 분석, ^15,16에서 특정 도구에 의해 해결 : 알고리즘 문제의 탄도를 재건에 사용되는 각 단계를 우려. 감지 후 수축을 구현하는 구조 봉우리는 초기에 인근, 강한 봉우리에 의해 숨겨져 있습니다. 참고, 탐지를 개선하는 것은 바로 궤도 내에 격차를 줄임으로써, 다시 연결 영향을 미칩니다. 공연은 일반적으로 높은 spatiotemporal 해상도에서 병렬 측정을위한 두 가지 주요 한계를 나타내는 다양한 라벨 밀도와 소음 값에 대한 몬테 칼로 시뮬레이션을 이용하여 평가되었다.

photoswitching 또는 비선형 광학에 / 오프 중 연속된을 사용하여 단일 분자를 위해 얻은 nanometric 정확도 ^17, 철저한 관찰을 제공할 수 있습니다. 이렇게 ¹⁷ 같은 스톰 ^18, 종려 ^19,20, RESOLFT ^{21 22,23을서도} 전혀 두려움을 모르는 강인한, whi 같은 nanoscopy 방법의 기초채널은 종종 이미지 고정 샘플을 요구할 수 있습니다. 중앙 작업은 단일 분자에서 냄새가 나는데 회절 – 제한된 봉우리의 탐지 및 추정이다. 따라서 이러한 브라운 운동 대신 상수 위치 정확도를 취급하는 등 적절한 가정을 제공 MTT는 straightforwardly nanoscopic 분석에 적합합니다. 또한, MTT는 근본적으로 모든 규모에서 사용할 수 있습니다 분자에 대한, 또한 세포 또는 동물만이 아니라, 예를 들면. 따라서 MTT는 분자 및 세포의 비늘에서 응용 프로그램을 발견 강력한 추적 알고리즘이다.

Protocol

이 동영상에서 우리는 특정 막 수용체를 타겟으로 양자 – 도트를 사용하여 완전한 하나의 입자 추적 실험을 제시한다. 이 실험의 주된 목표는 라이브 세포의 플라즈마 막 내에서 측정된 분자 확산 행동의 차별 다른 종류로 구성되어 있습니다. 사실, 막에서 발생하는 분자의 움직임은 일반적으로 선형적으로 감독이나 예를 들어 nanodomains 26-29, 내에 국한 됨으로써 브라운 확산 이탈하실 수 ?…

Discussion

단일 입자 추적에서 세포와 현미경 측면 옆에, 분석 작업의 상당한 부분을 나타냅니다. , 검출 추정하고 각 프레임 이상의 봉우리를 다시 연결 : 이것은 세 가지 주요 작업을 수행하는 데 사용되는 알고리즘을 해결합니다. 그러나이 작품의 결과의 양상은 마지막 여분의 단계 (예 : 운동 모드, 상호 작용 또는 stoichiometry를 해독 등)에 대한 본질적으로 새로운 헌신 조사를 위해 적응해야 할 수도 알고?…

Materials

Reagent	Company	Catalogue number	Quantity
Cos-7 cell line	ATCC	CRL-1651	5,000 cells/well
HBSS without Ca2+	GIBCO	14175	1 ml
0.05% Trypsin EDTA	GIBCO	25300	1 ml
8-well Lab-tek	NUNC	155441	1
QDot-605 streptavidin	Invitrogen	Q10101MP	20 mM
Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21)
Fab from mAb 108	ATCC	HB-9764	200 μg
NHS-Biotin	Thermo Scientific	21435	18.5 μg
Complete medium
DMEM	GIBCO	41965	500 ml
Fetal Bovine Serum	SIGMA	F7524	50 ml
L-Glutamine	GIBCO	25030	5 ml
HEPES	GIBCO	15630	5 ml
Sodium Pyruvate	GIBCO	11360	5 ml
Imaging medium
HBSS with Ca2+	GIBCO	14025	25 ml
HEPES	GIBCO	15630	250 μl

 

Equipment	Company	Reference
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TE2000U
Fluorescent lamp	Nikon	Intensilight C-HGFIE
1.3 NA 100x objective	Nikon	Plan Fluor 1.30
1.49 NA 100x objective	Nikon	APO TIRF 1.49
Camera	Roper Scientific	Cascade 512 B
Thermostated box	Life Imaging Services	The Box

Appendix: example Script of MTT supplementary analysis

function MTT_example(file_name)
%%% Basic examples showing how to recover MTT output results
%%% to plot each trace and to build the histogram
%%% of fluorescence intensities

if nargin<1 % no file_name provided?
    files = dir(‘*.stk’);
    if isempty(files), disp(‘no data in current dir’), return, end
    file_name = files(1).name; % default: first stk file
    disp([‘using’ file_name ‘by default’])
end

file_param = [file_name ‘_tab_param.dat’]; % output file

%% Load data
cd(‘output23′) % or (‘output22’), according to version used
% Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters,
% an extra parameter, noise, was added in version 2.3

% To read all parameters at once, in a single table
% tab_param = fread_all_param(file_param);
% tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = …

% To read all parameters (except frame_number) in separate tables
% [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param);

tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded!
tab_j= fread_data_spt(file_param, 4);
tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5);
tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8);

%% Loop over traces
N_traces = size(tab_i,1);
% Tables are N_traces lines by N_frames colums

for itrc = 1:N_traces
    No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only
     plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index))
    xlabel(‘i (pixel)’), ylabel(‘j (pixel)’)
    title([‘trace # ‘ num2str(itrc)])
    disp(‘Please strike any key for next trace’), pause
end

%% Fluo histogram
N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only
hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins
xlabel(‘intensity (a.u.)’), ylabel(‘occurrence’)
title(‘histogram of particles fluorescence intensity’)