Het in kaart brengen moleculaire diffusie in het plasmamembraan door Multiple-Target Tracing (MTT)

Summary

Multiple-Target Tracing is een zelfgemaakte algoritme dat is ontwikkeld voor het bijhouden van individueel gelabelde moleculen in het plasmamembraan van levende cellen. Efficiënt opsporen, schatten en het opsporen van moleculen loop van de tijd bij hoge dichtheid zorgen voor een gebruiksvriendelijke, uitgebreide tool om nanoschaal membraan dynamiek te onderzoeken.

Abstract

Ons doel is het verkrijgen van een uitgebreide beschrijving van moleculaire processen die zich op cellulaire membranen in verschillende biologische functies. Wij richten ons op het karakteriseren van de complexe organisatie en de dynamiek van het plasmamembraan bij single-molecule-niveau, door het ontwikkelen van analytische tools gewijd aan Single-Particle Tracking (SPT) bij hoge dichtheid: Multiple-Target Tracing (MTT) ^1. Single-molecule videomicroscopy, het aanbieden van milliseconde en nanometrische resolutie ^1-11, laat een gedetailleerde weergave van membraan organisatie ^12-14 door nauwkeurig in kaart brengen van omschrijvingen zoals mobiele receptoren lokalisatie, mobiliteit, opsluiting of interacties.

We herzien SPT, zowel experimenteel als algoritmisch. Experimentele aspecten omvatte het optimaliseren van installatie-en cel etikettering, met een bijzondere nadruk op het bereiken van de hoogst mogelijke etikettering dichtheid, met het oog op een dynamische momentopname van moleculaire dynamica a. het verstrekken vans het plaatsvindt binnen het membraan. Algoritmische problemen betrokken elke stap wordt gebruikt voor de wederopbouw van trajecten: pieken detectie, schatting en opnieuw verbinden, aangepakt door specifieke tools van beeldanalyse ^15,16. Uitvoering van deflatie na detectie kan redden van pieken in eerste instantie verborgen door naburige, sterkere pieken. Van de nota, het verbeteren van detectie direct invloed op heraansluiting, door vermindering van de lacunes binnen de trajecten. Optredens zijn onderzocht met behulp van Monte-Carlo simulaties voor verschillende etikettering dichtheid en geruisloosheid, die doorgaans de twee belangrijkste beperkingen voor parallelle metingen bij hoge spatio-temporele resolutie.

De nanometrische nauwkeurigheid ¹⁷ verkregen voor enkele moleculen, met behulp van opeenvolgende aan / uit photoswitching of niet-lineaire optica, kan leveren uitputtend waarnemingen. Dit is de basis van nanoscopy methoden ¹⁷ zoals STORM ^18, PALM ^19,20, RESOLFT ²¹ of STED ^22,23, whilel kan vaak beeldvorming gefixeerde monsters. De centrale taak is het opsporen en de schatting van diffractie-beperkte pieken afkomstig van enkele moleculen. Vandaar dat het verstrekken van adequate veronderstellingen, zoals het hanteren van een constante positionele nauwkeurigheid in plaats van de Brownse beweging, wordt MTT ronduit geschikt voor nanoscopische analyses. Bovendien kan MTT fundamenteel worden gebruikt op elke schaal: niet alleen moleculen, maar ook voor cellen of dieren, bijvoorbeeld. Vandaar dat MTT is een krachtige tracking algorithme, dat toepassing vindt op moleculair en cellulair schalen.

Protocol

In deze video presenteren wij een volledige Single Particle Tracking experiment, met behulp van quantum-dots gericht op een specifieke membraan receptor. Het belangrijkste doel van dit experiment bestaat bij het onderscheiden van verschillende soorten moleculaire diffusie gedrag gemeten binnen de plasmamembraan van levende cellen. Inderdaad, moleculaire bewegingen die zich voordoen in het membraan meestal afwijken van Brownse diffusie door te worden lineair gericht of beperkt binnen nanodomains 26-29, bijvoor…

Discussion

In enkele deeltjes volgen, naast de cel en microscopie aspecten de analyse een aanzienlijk deel van het werk. Dit heeft betrekking op het algoritme gebruikt om de drie belangrijkste taken uit te voeren: het opsporen, schatten en opnieuw aansluiten van toppen boven elk frame. Maar de daaruit voortvloeiende aspect van dit werk ligt in de uitwerking van het algoritme zelf, die dienen te worden aangepast voor een nieuw speciaal onderzoek, hoofdzakelijk voor de laatste, extra stappen (zoals het ontcijferen van vormen van bew…

Materials

Reagent	Company	Catalogue number	Quantity
Cos-7 cell line	ATCC	CRL-1651	5,000 cells/well
HBSS without Ca2+	GIBCO	14175	1 ml
0.05% Trypsin EDTA	GIBCO	25300	1 ml
8-well Lab-tek	NUNC	155441	1
QDot-605 streptavidin	Invitrogen	Q10101MP	20 mM
Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21)
Fab from mAb 108	ATCC	HB-9764	200 μg
NHS-Biotin	Thermo Scientific	21435	18.5 μg
Complete medium
DMEM	GIBCO	41965	500 ml
Fetal Bovine Serum	SIGMA	F7524	50 ml
L-Glutamine	GIBCO	25030	5 ml
HEPES	GIBCO	15630	5 ml
Sodium Pyruvate	GIBCO	11360	5 ml
Imaging medium
HBSS with Ca2+	GIBCO	14025	25 ml
HEPES	GIBCO	15630	250 μl

 

Equipment	Company	Reference
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TE2000U
Fluorescent lamp	Nikon	Intensilight C-HGFIE
1.3 NA 100x objective	Nikon	Plan Fluor 1.30
1.49 NA 100x objective	Nikon	APO TIRF 1.49
Camera	Roper Scientific	Cascade 512 B
Thermostated box	Life Imaging Services	The Box

Appendix: example Script of MTT supplementary analysis

function MTT_example(file_name)
%%% Basic examples showing how to recover MTT output results
%%% to plot each trace and to build the histogram
%%% of fluorescence intensities

if nargin<1 % no file_name provided?
    files = dir(‘*.stk’);
    if isempty(files), disp(‘no data in current dir’), return, end
    file_name = files(1).name; % default: first stk file
    disp([‘using’ file_name ‘by default’])
end

file_param = [file_name ‘_tab_param.dat’]; % output file

%% Load data
cd(‘output23′) % or (‘output22’), according to version used
% Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters,
% an extra parameter, noise, was added in version 2.3

% To read all parameters at once, in a single table
% tab_param = fread_all_param(file_param);
% tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = …

% To read all parameters (except frame_number) in separate tables
% [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param);

tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded!
tab_j= fread_data_spt(file_param, 4);
tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5);
tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8);

%% Loop over traces
N_traces = size(tab_i,1);
% Tables are N_traces lines by N_frames colums

for itrc = 1:N_traces
    No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only
     plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index))
    xlabel(‘i (pixel)’), ylabel(‘j (pixel)’)
    title([‘trace # ‘ num2str(itrc)])
    disp(‘Please strike any key for next trace’), pause
end

%% Fluo histogram
N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only
hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins
xlabel(‘intensity (a.u.)’), ylabel(‘occurrence’)
title(‘histogram of particles fluorescence intensity’)