Несколько-Target Трассировка домашнее алгоритм, разработанный для отслеживания индивидуально меченых молекул в мембране живой клетки. Эффективное обнаружение, оценку и отслеживание молекул с течением времени при высокой плотности обеспечивает удобный, комплексный инструмент для исследования наноразмерных динамика мембраны.
Нашей целью является получить подробное описание молекулярных процессов, происходящих в клеточных мембранах в различных биологических функций. Мы стремимся характеризующие сложную организацию и динамику плазматической мембраны в одной молекуле уровне, путем разработки аналитических средств, предназначенных для Одночастичные Tracking (SPT) при высокой плотности: Несколько-Target Tracing (МТТ) 1. Одиночных молекул видеомикроскопии, предлагая миллисекунды и разрешение нанометрового 1-11, позволяет детальное представление мембраны организации 12-14, точно отображение дескрипторов, таких как клеточные рецепторы локализация, подвижность, родов или взаимодействий.
Мы вновь SPT, как экспериментально, так и алгоритмически. Экспериментальные аспекты включены оптимизации установки и мечения клеток, с особым акцентом на достижение максимально возможной плотности маркировки, с тем чтобы обеспечить динамический снимок молекулярной динамикии все происходит внутри мембраны. Алгоритмические вопросы, касающиеся каждого шага для восстановления траектории: пики обнаружения, оценки и воссоединения, рассмотрены конкретные инструменты анализа изображений 15,16. Реализация дефляции после обнаружения позволяет спасать пики изначально скрыты от соседних, более сильные пики. Следует отметить, что улучшение обнаружения непосредственно влияет на повторное, на сокращение разрыва в траектории. Выступления были оценены с использованием метода Монте-Карло для маркировки различной плотности и шум значения, которые обычно представляют собой два основных ограничения на параллельных измерений при высокой пространственно-временной разрешение.
Нанометрового точность 17 получены отдельные молекулы, используя либо последовательного включения / выключения photoswitching и нелинейной оптике, могут обеспечить исчерпывающую наблюдений. Это является основой наноскопия 17 таких методов, как STORM 18 PALM 19,20, 21 или RESOLFT Стед 22,23, бееч. часто требуют фиксированных изображений образцов. Главной задачей является выявление и оценка дифракционного пика, исходящих из одной молекулы. Таким образом, обеспечение надлежащего предположения, такие как обработка постоянная точность позиционирования, а броуновское движение, МТТ прямо подходит для наноскопических анализа. Кроме того, МТТ может принципиально быть использован на любом уровне: не только для молекул, но и для клеток или животных, например. Таким образом, МТТ является мощным алгоритм слежения, что находит применение в молекулярной и клеточной масштабах.
В одночастичной слежения, рядом с клеткой и микроскопии аспекты, анализ представляет собой значительную часть работы. Это решает алгоритм, используемый для выполнения трех основных задач: выявление, оценка и снова пики над каждым кадром. Но последующее аспектом этой работы заключаетс?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим членов нашей команды, в частности, MC Блаш для оказания технической помощи, а также M Irla и B Imhof, за их поддержку и плодотворные обсуждения. Данные по дефляции и удержания воспроизводится любезность природы методы. Проект осуществляется при поддержке институциональных грантов из CNRS, INSERM и Марсель университета, а также конкретных грантов из региона Прованс-Альпы-Кот-d'Azur, Национальный институт рака дю, Agence Nationale-де-ла Recherche (ANR-08-PCVI- 0034-02, 2010 ANR Блан 1214 01) и Фонд застывания La Recherche Medicale (Equipe labélisée FRM-2009). ВР поддерживает общение с Ligue Nationale Рак Contre ле.
Reagent | Company | Catalogue number | Quantity |
Cos-7 cell line | ATCC | CRL-1651 | 5,000 cells/well |
HBSS without Ca2+ | GIBCO | 14175 | 1 ml |
0.05% Trypsin EDTA | GIBCO | 25300 | 1 ml |
8-well Lab-tek | NUNC | 155441 | 1 |
QDot-605 streptavidin | Invitrogen | Q10101MP | 20 mM |
Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21) | |||
Fab from mAb 108 | ATCC | HB-9764 | 200 μg |
NHS-Biotin | Thermo Scientific | 21435 | 18.5 μg |
Complete medium | |||
DMEM | GIBCO | 41965 | 500 ml |
Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | 50 ml |
L-Glutamine | GIBCO | 25030 | 5 ml |
HEPES | GIBCO | 15630 | 5 ml |
Sodium Pyruvate | GIBCO | 11360 | 5 ml |
Imaging medium | |||
HBSS with Ca2+ | GIBCO | 14025 | 25 ml |
HEPES | GIBCO | 15630 | 250 μl |
Equipment | Company | Reference |
Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000U |
Fluorescent lamp | Nikon | Intensilight C-HGFIE |
1.3 NA 100x objective | Nikon | Plan Fluor 1.30 |
1.49 NA 100x objective | Nikon | APO TIRF 1.49 |
Camera | Roper Scientific | Cascade 512 B |
Thermostated box | Life Imaging Services | The Box |
Appendix: example Script of MTT supplementary analysis
function MTT_example(file_name)
%%% Basic examples showing how to recover MTT output results
%%% to plot each trace and to build the histogram
%%% of fluorescence intensities
if nargin<1 % no file_name provided?
files = dir(‘*.stk’);
if isempty(files), disp(‘no data in current dir’), return, end
file_name = files(1).name; % default: first stk file
disp([‘using’ file_name ‘by default’])
end
file_param = [file_name ‘_tab_param.dat’]; % output file
%% Load data
cd(‘output23′) % or (‘output22’), according to version used
% Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters,
% an extra parameter, noise, was added in version 2.3
% To read all parameters at once, in a single table
% tab_param = fread_all_param(file_param);
% tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = …
% To read all parameters (except frame_number) in separate tables
% [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param);
tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded!
tab_j= fread_data_spt(file_param, 4);
tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5);
tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8);
%% Loop over traces
N_traces = size(tab_i,1);
% Tables are N_traces lines by N_frames colums
for itrc = 1:N_traces
No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only
plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index))
xlabel(‘i (pixel)’), ylabel(‘j (pixel)’)
title([‘trace # ‘ num2str(itrc)])
disp(‘Please strike any key for next trace’), pause
end
%% Fluo histogram
N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only
hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins
xlabel(‘intensity (a.u.)’), ylabel(‘occurrence’)
title(‘histogram of particles fluorescence intensity’)