Kvantitativ mätning av Invadopodia-medierad extracellulär matrix proteolys i enkel-och flercelliga kontexter
Summary
Vi beskriver den prototypiska metod för att framställa mikroskop täckglas belagda med fluorescerande gelatin för att visualisera invadopodia-medierad matrisnedbrytning. Beräkningstekniker med tillgänglig programvara presenteras för att kvantifiera de resulterande nivåerna av matris proteolys av enskilda celler i en blandad befolkning och för flercelliga grupper som utövar hela mikroskopiska fält.
Abstract
Cellulär invasion till lokala vävnader är en process viktig för utveckling och homeostas. Malregulated invasion och efterföljande cellrörelse är karakteristisk för flera patologiska processer, inklusive inflammation, hjärt-kärlsjukdomar och tumörcellmetastas 1. Focalized proteolytisk nedbrytning av extracellulära matris (ECM) komponenter i det epiteliska eller endoteliala basalmembranet är ett kritiskt steg i att initiera cellulär invasion. I tumörceller har omfattande in vitro-analys fastställt att ECM-nedbrytning åstadkommes genom ventrala aktin-rika membran FRAMSKJUTANDE strukturer benämnda invadopodia 2,3. Invadopodia form i nära apposition till ECM, där de måttlig ECM nedbrytning genom verkan av metalloproteinaser (MMP). Förmågan hos tumörceller att bilda invadopodia korrelerar direkt med förmågan att invadera lokala in stroma och tillhörande vaskulära komponenter 3.
_content "> Visualisering av invadopodia-medierad ECM-nedbrytning av celler genom fluorescensmikroskopi med färgämnesmärkta matrisproteiner belagda på täckglas har blivit den vanligaste tekniken för att utvärdera graden av matris proteolys och cellulär invasiv potential 4,5. Här beskriver vi en version av standardmetoden för att generera fluorescensmärkta täckglas med användning av en kommersiellt tillgänglig Oregon Grön-488 gelatin konjugat. Denna metod är lätt skalas att snabbt framställa stora antal av belagda täckglas. Vi visar några av de vanligaste mikroskopiska artefakter som ofta påträffas under denna procedur och hur dessa kan undvikas. Slutligen beskriver vi standardiserade metoder med lättillgänglig programvara för att möjliggöra kvantifiering av märkt gelatin matrisnedbrytning medierad av enskilda celler och hela cellpopulationer. De beskrivna förfarandena ger möjlighet att exakt och reproducerbart övervaka invadopodiaaktivitet, och kan också fungera som en plattform för att utvärdera effekten av modulera proteinexpression eller testning av anti-invasiva föreningar på extracellulär matrisnedbrytning i enkel-och flercelliga inställningar.Protocol
Discussion
Förmågan att visualisera celler bryter ned den extracellulära matrisen har hjälpt att upptäcka de molekylära mekanismerna som används i de tidiga stegen av cellinvasion. Uppfunnen av Wen-Tien Chen i början av 1980-talet 4,14,15, har beläggning fluorescensmärkta extracellulära proteiner på täckglas för efterföljande mikroskopisk analys fram som den primära tekniken för att utvärdera invadopodia funktion inom ett brett spektrum av celltyper. Den föreskrivna protokollet visar den grundläggand…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av kapitalförsäkringar medel från West Virginia University Mary Babb Randolph Cancer Center. Vi tackar Susette Mueller (Georgetown University) och Laura Kelley för tidig rådgivning och hjälp. Användningen av West Virginia University Mikroskopi Imaging Facility (stöds av Mary Babb Randolph Cancer Center och NIH bidrag P20 RR16440, P30 RR032138 och P30 GM103488) tas tacksamt erkänt.
Materials
| Name of Reagent/Instrument | Company | Catalogue Number | Comments |
| gelatin | Sigma | G1890 | Porcine skin |
| sucrose | Fisher | BP220 | |
| 12 mm coverslips | Fisher | 50-121-5159 | |
| 24 well plates | Fisher | 08-772-1 | BD Falcon |
| nitric acid | Ricca | R5326000 | 20% solution |
| poly-L-lysine | Electron Microscopy Sciences | 19320-B | 0.1% solution |
| glutaraldehyde | Sigma | G7526 | 8% solution |
| Oregon Green 488-conjugated gelatin | Invitrogen | G-13186 | |
| sodium borohydride | Sigma | 213462 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | |
| rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| anti-cortactin (clone 4F11) | Millipore | 05-180 | |
| Anti-FLAG antibody | Millipore | MAB3118 | |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A21235 | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| LSM 510 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| AutoQuant X2.2 software | Media Cybernetics | ||
| NIS Elements software | Nikon |
References
- Ridley, A. J. Life at the leading edge. Cell. 145, 1012-1022 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The ‘ins’ and ‘outs’ of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. , (2010).
- Chen, W. T., Chen, J. M., Parsons, S. J., Parsons, J. T. Local degradation of fibronectin at sites of expression of the transforming gene product pp60src. Nature. 316, 156-158 (1985).
- Artym, V. V., Zhang, Y., Seillier-Moiseiwitsch, F., Yamada, K. M., Mueller, S. C. Dynamic interactions of cortactin and membrane type 1 matrix metalloproteinase at invadopodia: defining the stages of invadopodia formation and function. Cancer Res. 66, 3034-3043 (2006).
- Ayala, I., et al. Multiple regulatory inputs converge on cortactin to control invadopodia biogenesis and extracellular matrix degradation. J. Cell Sci. , (2008).
- Ammer, A. G., et al. Saracatinib impairs head and neck squamous cell carcinoma invasion by disrupting invadopodia function. J. Cancer Sci. Ther. 1, 52-61 (2009).
- Seals, D. F., et al. The adaptor protein Tks5/Fish is required for podosome formation and function, and for the protease-driven invasion of cancer cells. Cancer Cell. 7, 155-165 (2005).
- Yamaguchi, H., et al. Molecular mechanisms of invadopodium formation: the role of the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin. J. Cell Biol. 168, 441-452 (2005).
- Kopp, P., et al. The kinesin KIF1C and microtubule plus ends regulate podosome dynamics in macrophages. Mol. Biol. Cell. 17, 2811-2823 (2006).
- Oser, M., et al. Cortactin regulates cofilin and N-WASp activities to control the stages of invadopodium assembly and maturation. J. Cell. Biol. 186, 571-587 (2009).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
- Kelley, L. C., et al. Oncogenic Src requires a wild-type counterpart to regulate invadopodia maturation. J. Cell Sci. 123, 3923-3932 (2010).
- Chen, W. T., Singer, S. J. Fibronectin is not present in the focal adhesions formed between normal cultured fibroblasts and their substrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7318-7322 (1980).
- Chen, W. T., Olden, K., Bernard, B. A., Chu, F. F. Expression of transformation-associated protease(s) that degrade fibronectin at cell contact sites. J. Cell Biol. 98, 1546-1555 (1984).
- Bharti, S., et al. Src-dependent phosphorylation of ASAP1 regulates podosomes. Mol. Cell Biol. 27, 8271-8283 (2007).
- Albrechtsen, R., Stautz, D., Sanjay, A., Kveiborg, M., Wewer, U. M. Extracellular engagement of ADAM12 induces clusters of invadopodia with localized ectodomain shedding activity. Exp. Cell Res. 317 (10), 195-209 (2011).
- Scott, R. W., et al. kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells. J. Cell Biol. 191, 169-185 (2010).
- Mueller, S. C., Yeh, Y., Chen, W. T. Tyrosine phosphorylation of membrane proteins mediates cellular invasion by transformed cells. J. Cell. Biol. 119, 1309-1325 (1992).
- Bowden, E. T., Coopman, P. J., Mueller, S. C. Invadopodia: unique methods for measurement of extracellular matrix degradation in vitro. Methods Cell Biol. 63, 613-627 (2001).
- Baldassarre, M., et al. Dynamin participates in focal extracellular matrix degradation by invasive cells. Mol. Biol. Cell. 14, 1074-1084 (2003).
- Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr. Biol. 18, 1295-1299 (2008).
- Artym, V. V., Yamada, K. M., Mueller, S. C. ECM degradation assays for analyzing local cell invasion. Methods Mol. Biol. 522, 211-219 (2009).
- Schoumacher, M., Goldman, R. D., Louvard, D., Vignjevic, D. M. Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of invadopodia. J. Cell Biol. 189, 541-556 (2010).
- Clark, E. S., Whigham, A. S., Yarbrough, W. G., Weaver, A. M. Cortactin is an essential regulator of matrix metalloproteinase secretion and extracellular matrix degradation in invadopodia. Cancer Res. 67, 4227-4235 (2007).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphoinositide 3-kinase signaling pathway mediated by p110alpha regulates invadopodia formation. J. Cell Biol. 193, 1275-1288 (2011).
- Li, A., et al. The actin-bundling protein fascin stabilizes actin in invadopodia and potentiates protrusive invasion. Curr. Biol. 20, 339-345 (2010).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and PIP5-kinase Ialpha are required for invadopodia formation in human breast cancer cells. Cancer Sci. , (2010).
