Kwantitatieve meting van Invadopodia-gemedieerde extracellulaire matrix proteolyse in Single en Meercellige contexten
Summary
We beschrijven de prototypische werkwijze voor het produceren microscoop dekglaasje bedekt met fluorescent gelatine visualiseren invadopodia-gemedieerde matrixafbraak. Rekentechnieken met beschikbare software gepresenteerd voor het kwantificeren van de niveaus van resulterende matrix proteolyse door enkele cellen in een gemengde populatie en voor meercellige groepen omvat gehele microscopische velden.
Abstract
Cellulaire invasie in de lokale weefsels is een proces van belang in de ontwikkeling en homeostase. Malregulated invasie en daaropvolgende cel beweging is kenmerkend meerdere pathologische processen, waaronder ontsteking, cardiovasculaire ziekte en tumorcel metastase 1. Gefocaliseerd proteolytische afbraak van extracellulaire matrix (ECM) in de epitheliale of endotheliale basaalmembraan is een kritische stap in de inleiding cellulaire invasie. In tumorcellen is uitgebreid in vitro analyse vastgesteld dat ECM afbraak wordt bereikt door ventrale actine-rijke membraan protrusive structuren genoemd invadopodia 2,3. Invadopodia vorm in nauwe appositie de ECM, waar ECM afbraak matigen door de werking van matrix metalloproteinases (MMP's). Het vermogen van tumorcellen om invadopodia vormen correleert direct met de mogelijkheid om binnen te dringen in lokale stroma en geassocieerde vasculaire componenten 3.
_content "> Visualisatie van invadopodia-gemedieerde ECM afbraak van cellen door fluorescentiemicroscopie met kleurstof gemerkte eiwitten matrix aangebracht op dekglaasjes heeft zich ontwikkeld tot de meest voorkomende techniek voor het evalueren van de mate van proteolyse en cellulaire matrix invasieve potentieel 4,5. Hier beschrijven we een versie van de standaard werkwijze voor het fluorescentie-gemerkte dekglaasjes met behulp van een commercieel verkrijgbare Oregon Green-488 gelatine conjugaat. Deze methode is eenvoudig geschaald snel worden grote aantallen beklede dekglaasjes. We tonen enkele van de gemeenschappelijke microscopische artefacten die vaak optreden tijdens deze procedure en hoe deze kan worden vermeden. Tenslotte we gestandaardiseerde methoden met behulp van gemakkelijk verkrijgbare computersoftware voor kwantificering van gemerkt gelatine matrix afbraak gemedieerd door individuele cellen en gehele celpopulaties kunnen beschrijven. beschreven procedures de mogelijkheid bieden om nauwkeurig en reproduceerbaar te controleren invadopodiaactiviteit, en kan ook dienen als een platform voor het evalueren van de werkzaamheid van modulerende eiwitexpressie of testen van anti-invasieve verbindingen op extracellulaire matrix afbraak in enkele en meercellige instellingen.Protocol
Discussion
De mogelijkheid om cellen verslechtering van de extracellulaire matrix te visualiseren heeft bijgedragen tot het ontdekken van de moleculaire mechanismen die werkzaam zijn in de vroege stappen van celinvasie. Ontwikkeld door Wen-Tien Chen in de vroege jaren 1980 4,14,15, heeft coating fluorescent gelabelde extracellulaire eiwitten op dekglaasjes voor daaropvolgende microscopische analyse bleek de primaire techniek evaluatie invadopodia functie in een breed bereik aan celtypen. Het voorgeschreven toont de basi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door fondsen uit schenkingen van de Universiteit van West Virginia Mary Babb Randolph Cancer Center. Wij danken Susette Mueller (Georgetown University) en Laura Kelley voor vroege advies en bijstand. Het gebruik van de Universiteit van West Virginia Microscopie Imaging Facility (ondersteund door de Mary Babb Randolph Cancer Center en, NIH subsidies P20 RR16440, P30 en P30 RR032138 GM103488) wordt dankbaar erkend.
Materials
| Name of Reagent/Instrument | Company | Catalogue Number | Comments |
| gelatin | Sigma | G1890 | Porcine skin |
| sucrose | Fisher | BP220 | |
| 12 mm coverslips | Fisher | 50-121-5159 | |
| 24 well plates | Fisher | 08-772-1 | BD Falcon |
| nitric acid | Ricca | R5326000 | 20% solution |
| poly-L-lysine | Electron Microscopy Sciences | 19320-B | 0.1% solution |
| glutaraldehyde | Sigma | G7526 | 8% solution |
| Oregon Green 488-conjugated gelatin | Invitrogen | G-13186 | |
| sodium borohydride | Sigma | 213462 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | |
| rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| anti-cortactin (clone 4F11) | Millipore | 05-180 | |
| Anti-FLAG antibody | Millipore | MAB3118 | |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A21235 | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| LSM 510 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| AutoQuant X2.2 software | Media Cybernetics | ||
| NIS Elements software | Nikon |
References
- Ridley, A. J. Life at the leading edge. Cell. 145, 1012-1022 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The ‘ins’ and ‘outs’ of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. , (2010).
- Chen, W. T., Chen, J. M., Parsons, S. J., Parsons, J. T. Local degradation of fibronectin at sites of expression of the transforming gene product pp60src. Nature. 316, 156-158 (1985).
- Artym, V. V., Zhang, Y., Seillier-Moiseiwitsch, F., Yamada, K. M., Mueller, S. C. Dynamic interactions of cortactin and membrane type 1 matrix metalloproteinase at invadopodia: defining the stages of invadopodia formation and function. Cancer Res. 66, 3034-3043 (2006).
- Ayala, I., et al. Multiple regulatory inputs converge on cortactin to control invadopodia biogenesis and extracellular matrix degradation. J. Cell Sci. , (2008).
- Ammer, A. G., et al. Saracatinib impairs head and neck squamous cell carcinoma invasion by disrupting invadopodia function. J. Cancer Sci. Ther. 1, 52-61 (2009).
- Seals, D. F., et al. The adaptor protein Tks5/Fish is required for podosome formation and function, and for the protease-driven invasion of cancer cells. Cancer Cell. 7, 155-165 (2005).
- Yamaguchi, H., et al. Molecular mechanisms of invadopodium formation: the role of the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin. J. Cell Biol. 168, 441-452 (2005).
- Kopp, P., et al. The kinesin KIF1C and microtubule plus ends regulate podosome dynamics in macrophages. Mol. Biol. Cell. 17, 2811-2823 (2006).
- Oser, M., et al. Cortactin regulates cofilin and N-WASp activities to control the stages of invadopodium assembly and maturation. J. Cell. Biol. 186, 571-587 (2009).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
- Kelley, L. C., et al. Oncogenic Src requires a wild-type counterpart to regulate invadopodia maturation. J. Cell Sci. 123, 3923-3932 (2010).
- Chen, W. T., Singer, S. J. Fibronectin is not present in the focal adhesions formed between normal cultured fibroblasts and their substrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7318-7322 (1980).
- Chen, W. T., Olden, K., Bernard, B. A., Chu, F. F. Expression of transformation-associated protease(s) that degrade fibronectin at cell contact sites. J. Cell Biol. 98, 1546-1555 (1984).
- Bharti, S., et al. Src-dependent phosphorylation of ASAP1 regulates podosomes. Mol. Cell Biol. 27, 8271-8283 (2007).
- Albrechtsen, R., Stautz, D., Sanjay, A., Kveiborg, M., Wewer, U. M. Extracellular engagement of ADAM12 induces clusters of invadopodia with localized ectodomain shedding activity. Exp. Cell Res. 317 (10), 195-209 (2011).
- Scott, R. W., et al. kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells. J. Cell Biol. 191, 169-185 (2010).
- Mueller, S. C., Yeh, Y., Chen, W. T. Tyrosine phosphorylation of membrane proteins mediates cellular invasion by transformed cells. J. Cell. Biol. 119, 1309-1325 (1992).
- Bowden, E. T., Coopman, P. J., Mueller, S. C. Invadopodia: unique methods for measurement of extracellular matrix degradation in vitro. Methods Cell Biol. 63, 613-627 (2001).
- Baldassarre, M., et al. Dynamin participates in focal extracellular matrix degradation by invasive cells. Mol. Biol. Cell. 14, 1074-1084 (2003).
- Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr. Biol. 18, 1295-1299 (2008).
- Artym, V. V., Yamada, K. M., Mueller, S. C. ECM degradation assays for analyzing local cell invasion. Methods Mol. Biol. 522, 211-219 (2009).
- Schoumacher, M., Goldman, R. D., Louvard, D., Vignjevic, D. M. Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of invadopodia. J. Cell Biol. 189, 541-556 (2010).
- Clark, E. S., Whigham, A. S., Yarbrough, W. G., Weaver, A. M. Cortactin is an essential regulator of matrix metalloproteinase secretion and extracellular matrix degradation in invadopodia. Cancer Res. 67, 4227-4235 (2007).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphoinositide 3-kinase signaling pathway mediated by p110alpha regulates invadopodia formation. J. Cell Biol. 193, 1275-1288 (2011).
- Li, A., et al. The actin-bundling protein fascin stabilizes actin in invadopodia and potentiates protrusive invasion. Curr. Biol. 20, 339-345 (2010).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and PIP5-kinase Ialpha are required for invadopodia formation in human breast cancer cells. Cancer Sci. , (2010).
