מדידת כמותית של Proteolysis מטריקס invadopodia בתיווך בקשרים יחידים ורבים תאיים
Summary
אנו מתארים את שיטת האבטיפוס לייצור coverslips מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצופה ג'לטין להמחשת הפחתת מטריצת invadopodia בתיווך. טכניקות חישוב באמצעות תוכנה זמינה מוצגות לכימות הרמות כתוצאה של proteolysis מטריצה של תאים בודדים בתוך אוכלוסייה מעורבת וקבוצות תאיות המקיפות את השדות מיקרוסקופים שלמים.
Abstract
פלישה ניידת לתוך רקמות מקומיות היא תהליך חשוב בפיתוח ובאיזון. פלישת Malregulated ותנועת התא הבאה היא אופיינית לתהליכים פתולוגיים רבים, כולל דלקת, מחלות לב וכלי דם וגרורות של תאי גידול 1. שפלת פרוטאוליטי Focalized של רכיבים תאיים מטריקס (ECM) בקרום המרתף אפיתל או האנדותל היא שלב קריטי בייזום פלישה סלולרית. בתאים סרטניים, רב בניתוח המבחנה קבעה כי השפלת ECM נעשתה על ידי מבני גחון יקטין עשיר קרום הבולט כינת invadopodia 2,3. צורת invadopodia בפרד קרוב לECM, שבו הם מנהלי התמוטטות ECM דרך הפעולה של מטריקס (metalloproteinases MMPs). היכולת של תאי גידול ליצירת invadopodia ישירות בקורלציה עם היכולת לפלוש לתוך stroma המקומי ורכיבים בכלי דם הקשורים 3.
_content "> ויזואליזציה של שפלת ECM invadopodia בתיווך של תאים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות חלבוני מטריצת צבע כותרת מצופית גבי הזכוכית coverslips התפתחה הטכניקה הנפוצה ביותר להערכת מידת proteolysis מטריצה והפוטנציאל פולשנית סלולרי 4,5. כאן אנו מתארים גרסה של השיטה הסטנדרטית לייצור הזכוכית coverslips כותרת-fluorescently ניצול גרין-488 הצמוד אורגון זמינה מסחרי ג'לטין. שיטה זו מדורגת בקלות לייצר במהירות כמויות גדולות של coverslips המצופה. אנחנו מראים כמה מהממצאים המיקרוסקופים הנפוצים, כי לעתים קרובות הם נתקלו במהלך הליך זה וכיצד אלה יכולים להימנע. לבסוף, אנו מתארים שיטות סטנדרטיות באמצעות תוכנת מחשב זמינה כדי לאפשר כימות של הפחתת מטריצת ג'לטין מסומן מתווכת על ידי תאים בודדים ועל ידי האוכלוסיות סלולריות כולו. ההליכים המתוארים לספק את היכולת במדויק וreproducibly לפקח invadopodiaפעילות, ויכול לשמש גם כפלטפורמה להערכת היעילות של ביטוי חלבון ויסות או בדיקה של תרכובות אנטי פולשניים בשפלת מטריקס בהגדרות בודדות ורבות תאיות.Protocol
1. ייצור של אורגון גרין Coverslips מצופה 488-ג'לטין הכן 5% ללא תווית (w / w) המלאה ג'לטין / פתרון סוכרוז על ידי הוספת 1.25 גרם ג'לטין וסוכרוז גרם 1.25 ב PBS לנפח סופי של 50 מ"ל. לחמם את פתרון ג'לטין המניות עד 37 מעלות צלזיוס, ולהבטי…
Discussion
היכולת לחזות תאים משפילים מטריקס סייעה בגילוי המנגנונים המולקולריים המועסקים בשלבים המוקדמים של פלישת תא. חלוץ ידי וון-טיין חן בתחילת 1980 4,14,15, ציפוי חלבונים תאיים שכותרתו fluorescently על coverslips זכוכית עבור ניתוח מיקרוסקופי שלאחר מכן התפתחו הטכניקה העיקרית בהערכת תפ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרנות המיועדות לאוניברסיטת מערב וירג'יניה מרי אב רנדולף מרכז הסרטן. אנו מודים סוזט מילר (אוניברסיטת ג'ורג'טאון) ולורה קלי לייעוץ וסיוע בשלב מוקדם. השימוש במתקן אוניברסיטת מערב וירג'יניה מיקרוסקופי ההדמיה (נתמך על ידי מרי אב רנדולף מרכז הסרטן ו, מענקי NIH P20 RR16440, P30 RR032138 וP30 GM103488) הוא בברכה.
Materials
| Name of Reagent/Instrument | Company | Catalogue Number | Comments |
| gelatin | Sigma | G1890 | Porcine skin |
| sucrose | Fisher | BP220 | |
| 12 mm coverslips | Fisher | 50-121-5159 | |
| 24 well plates | Fisher | 08-772-1 | BD Falcon |
| nitric acid | Ricca | R5326000 | 20% solution |
| poly-L-lysine | Electron Microscopy Sciences | 19320-B | 0.1% solution |
| glutaraldehyde | Sigma | G7526 | 8% solution |
| Oregon Green 488-conjugated gelatin | Invitrogen | G-13186 | |
| sodium borohydride | Sigma | 213462 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | |
| rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| anti-cortactin (clone 4F11) | Millipore | 05-180 | |
| Anti-FLAG antibody | Millipore | MAB3118 | |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A21235 | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| LSM 510 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| AutoQuant X2.2 software | Media Cybernetics | ||
| NIS Elements software | Nikon |
References
- Ridley, A. J. Life at the leading edge. Cell. 145, 1012-1022 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The ‘ins’ and ‘outs’ of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. , (2010).
- Chen, W. T., Chen, J. M., Parsons, S. J., Parsons, J. T. Local degradation of fibronectin at sites of expression of the transforming gene product pp60src. Nature. 316, 156-158 (1985).
- Artym, V. V., Zhang, Y., Seillier-Moiseiwitsch, F., Yamada, K. M., Mueller, S. C. Dynamic interactions of cortactin and membrane type 1 matrix metalloproteinase at invadopodia: defining the stages of invadopodia formation and function. Cancer Res. 66, 3034-3043 (2006).
- Ayala, I., et al. Multiple regulatory inputs converge on cortactin to control invadopodia biogenesis and extracellular matrix degradation. J. Cell Sci. , (2008).
- Ammer, A. G., et al. Saracatinib impairs head and neck squamous cell carcinoma invasion by disrupting invadopodia function. J. Cancer Sci. Ther. 1, 52-61 (2009).
- Seals, D. F., et al. The adaptor protein Tks5/Fish is required for podosome formation and function, and for the protease-driven invasion of cancer cells. Cancer Cell. 7, 155-165 (2005).
- Yamaguchi, H., et al. Molecular mechanisms of invadopodium formation: the role of the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin. J. Cell Biol. 168, 441-452 (2005).
- Kopp, P., et al. The kinesin KIF1C and microtubule plus ends regulate podosome dynamics in macrophages. Mol. Biol. Cell. 17, 2811-2823 (2006).
- Oser, M., et al. Cortactin regulates cofilin and N-WASp activities to control the stages of invadopodium assembly and maturation. J. Cell. Biol. 186, 571-587 (2009).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
- Kelley, L. C., et al. Oncogenic Src requires a wild-type counterpart to regulate invadopodia maturation. J. Cell Sci. 123, 3923-3932 (2010).
- Chen, W. T., Singer, S. J. Fibronectin is not present in the focal adhesions formed between normal cultured fibroblasts and their substrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7318-7322 (1980).
- Chen, W. T., Olden, K., Bernard, B. A., Chu, F. F. Expression of transformation-associated protease(s) that degrade fibronectin at cell contact sites. J. Cell Biol. 98, 1546-1555 (1984).
- Bharti, S., et al. Src-dependent phosphorylation of ASAP1 regulates podosomes. Mol. Cell Biol. 27, 8271-8283 (2007).
- Albrechtsen, R., Stautz, D., Sanjay, A., Kveiborg, M., Wewer, U. M. Extracellular engagement of ADAM12 induces clusters of invadopodia with localized ectodomain shedding activity. Exp. Cell Res. 317 (10), 195-209 (2011).
- Scott, R. W., et al. kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells. J. Cell Biol. 191, 169-185 (2010).
- Mueller, S. C., Yeh, Y., Chen, W. T. Tyrosine phosphorylation of membrane proteins mediates cellular invasion by transformed cells. J. Cell. Biol. 119, 1309-1325 (1992).
- Bowden, E. T., Coopman, P. J., Mueller, S. C. Invadopodia: unique methods for measurement of extracellular matrix degradation in vitro. Methods Cell Biol. 63, 613-627 (2001).
- Baldassarre, M., et al. Dynamin participates in focal extracellular matrix degradation by invasive cells. Mol. Biol. Cell. 14, 1074-1084 (2003).
- Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr. Biol. 18, 1295-1299 (2008).
- Artym, V. V., Yamada, K. M., Mueller, S. C. ECM degradation assays for analyzing local cell invasion. Methods Mol. Biol. 522, 211-219 (2009).
- Schoumacher, M., Goldman, R. D., Louvard, D., Vignjevic, D. M. Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of invadopodia. J. Cell Biol. 189, 541-556 (2010).
- Clark, E. S., Whigham, A. S., Yarbrough, W. G., Weaver, A. M. Cortactin is an essential regulator of matrix metalloproteinase secretion and extracellular matrix degradation in invadopodia. Cancer Res. 67, 4227-4235 (2007).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphoinositide 3-kinase signaling pathway mediated by p110alpha regulates invadopodia formation. J. Cell Biol. 193, 1275-1288 (2011).
- Li, A., et al. The actin-bundling protein fascin stabilizes actin in invadopodia and potentiates protrusive invasion. Curr. Biol. 20, 339-345 (2010).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and PIP5-kinase Ialpha are required for invadopodia formation in human breast cancer cells. Cancer Sci. , (2010).
Tags
Quantitative MeasurementInvadopodia-mediatedExtracellular Matrix ProteolysisSingle And Multicellular ContextsCellular InvasionDevelopmentHomeostasisMalregulated InvasionCell MovementPathological ProcessesInflammationCardiovascular DiseaseTumor Cell MetastasisProteolytic DegradationExtracellular Matrix (ECM)Epithelial Basement MembraneEndothelial Basement MembraneVentral Actin-rich Membrane Protrusive StructuresInvadopodiaMatrix Metalloproteinases (MMPs)Tumor CellsIn Vitro AnalysisECM DegradationFluorescent MicroscopyDye-labeled Matrix ProteinsGlass CoverslipsEvaluating Matrix ProteolysisCellular Invasive Potential
Citer Cet Article
Martin, K. H., Hayes, K. E., Walk, E. L., Ammer, A. G., Markwell, S. M., Weed, S. A. Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts. J. Vis. Exp. (66), e4119, doi:10.3791/4119 (2012).