シングルおよび多細胞コンテキストでInvadopodia媒介細胞外マトリックスタンパク分解の定量測定
Summary
我々はinvadopodia媒介マトリックス分解を可視化するための蛍光ゼラチンでコーティングされた顕微鏡のカバーガラスを製造するためのプロトタイプ的な方法を説明します。利用可能なソフトウェアを使用した計算手法は混合集団内および全体の顕微鏡視野を取り囲む多のグループに、単一細胞によるマトリックス分解の結果のレベルを定量化するために表示されている。
Abstract
地元組織への細胞浸潤は、開発と恒常性に重要なプロセスである。 Malregulated侵攻とその後の細胞運動は、炎症、心血管疾患や腫瘍細胞転移1を含む複数の病理学的プロセスの特徴である。上皮細胞や内皮の基底膜における細胞外マトリックス（ECM）成分のFocalizedタンパク質分解は細胞浸潤を開始する上で重要なステップである。腫瘍細胞では、in vitroでの解析では、広範なECM分解がinvadopodia 2,3と呼ばれる腹アクチンに富んだ膜突出構造によって達成されると判断しました。彼らはマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）の作用を介してECMの内訳は中等度のECMに近い同格のInvadopodiaフォーム。 invadopodiaを形成する腫瘍細胞の能力は直接ローカル間質および関連する血管成分3に侵入する能力と相関している。
カバーガラス上にコーティング色素標識マトリックスタンパク質を用いた蛍光顕微鏡による細胞の_content "の>可視invadopodia媒介ECM分解は、行列のタンパク質分解、4,5細胞の浸潤能の程度を評価するための最も一般的な手法として登場しましたが、ここでは説明し市販のオレゴングリーン-488ゼラチン複合体を利用した蛍光標識されたカバーガラスを生成するための標準メソッドのバージョン。このメソッドは、簡単に迅速にコーティングされたカバーガラスを大量に生成するためにスケーリングされます私たちはしばしば遭遇する一般的な顕微鏡の成果物の一部を示しています。この手順の中で、どのようにこれらを避けることができます最後に、我々は個々の細胞によって、全体の細胞集団によって媒介されるラベルの付いたゼラチンマトリックス分解の定量化を可能にするために容易に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して標準化された方法を説明します。説明する手順では、正確かつ再現性よく監視する機能を提供invadopodia活動、また、調節タンパク質の発現または単一および多設定で、細胞外マトリックス分解に及ぼす抗浸潤化合物の試験の有効性を評価するためのプラットフォームとして機能することができます。Protocol
1。オレゴングリーンの生産488-ゼラチン被覆カバーガラス 50ミリリットルの最終体積になるようにPBSで1.25グラムゼラチン及び1.25グラムのショ糖を加えることによって標識されていない5％（w / w）の株式ゼラチン/ショ糖溶液を調製します。 37°Cから株式ゼラチン溶液を温め、それを完全に使用する前に溶けていることを確認します。 4℃で最終混合物を保管 24ウェルプラスチッ?…
Discussion
細胞外マトリックス分解細胞を可視化する能力は、細胞侵入の初期段階で採用する分子メカニズムを発見する際に支援しています。 1980年代初期の4,14,15のWEN-ティエンチェンによって開拓、その後の顕微鏡分析用のカバーガラス上にコーティング蛍光標識された細胞外タンパク質は、細胞の種類の広い範囲にわたってinvadopodia機能を評価する上で主要な技術として浮上している。所定?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ウェストバージニア大学メアリーBabbのランドルフがんセンターからの寄付金によって支えられている。我々は、早期の助言や支援をスゼットミューラー（ジョージタウン大学）とローラ·ケリーに感謝します。ウェストバージニア大学顕微鏡イメージング機能（メアリーBabbのランドルフがんセンターと、NIHの助成P20 RR16440、P30およびP30 RR032138 GM103488でサポートされている）の使用は感謝して承諾されます。
Materials
| Name of Reagent/Instrument | Company | Catalogue Number | Comments |
| gelatin | Sigma | G1890 | Porcine skin |
| sucrose | Fisher | BP220 | |
| 12 mm coverslips | Fisher | 50-121-5159 | |
| 24 well plates | Fisher | 08-772-1 | BD Falcon |
| nitric acid | Ricca | R5326000 | 20% solution |
| poly-L-lysine | Electron Microscopy Sciences | 19320-B | 0.1% solution |
| glutaraldehyde | Sigma | G7526 | 8% solution |
| Oregon Green 488-conjugated gelatin | Invitrogen | G-13186 | |
| sodium borohydride | Sigma | 213462 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | |
| rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| anti-cortactin (clone 4F11) | Millipore | 05-180 | |
| Anti-FLAG antibody | Millipore | MAB3118 | |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A21235 | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| LSM 510 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| AutoQuant X2.2 software | Media Cybernetics | ||
| NIS Elements software | Nikon |
References
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Citer Cet Article
Martin, K. H., Hayes, K. E., Walk, E. L., Ammer, A. G., Markwell, S. M., Weed, S. A. Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts. J. Vis. Exp. (66), e4119, doi:10.3791/4119 (2012).