단일 및 다세포 상황에서 Invadopodia로 인한 세포 외 기질 Proteolysis의 양적 측정
Summary
우리는 invadopodia로 인한 매트릭스 저하를 시각화를위한 형광 젤라틴으로 코팅 현미경 coverslips를 생산을위한 원형 방법을 설명합니다. 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 전산 기술이 혼합 된 인구 내에 전체 미세 필드를 포함한 다세포 그룹에 대한 하나의 세포 매트릭스 proteolysis의 결과 수준을 정량화를 위해 제공됩니다.
Abstract
지역 조직에 세포 침공은 개발과 항상성에서 중요한 과정입니다. Malregulated 침공과 이후의 세포 운동은 염증, 심장 혈관 질환과 종양 세포 전이 한 등 여러 가지 병적 인 프로세스의 특징입니다. 상피 또는 내피 지하 막에서 세포 외 기질 (ECM)의 구성 요소 Focalized proteolytic 저하는 세포 침공을 시작으로 중요한 단계입니다. 종양 세포에서 체외 분석에 광범위한는 ECM 저하가 invadopodia 2,3를 칭했다 복부 고를 풍부한 막 밀어내는 구조에 의해 수행되는 결정을 내 렸습니다. 그들은 매트릭스 metalloproteinases (MMPs)의 행동을 통해 ECM 분석을 검토 ECM에 가까운 동격의 Invadopodia 양식. invadopodia을 형성하는 종양 세포의 능력은 바로 지역의 기질 및 관련 혈관 구성 요소를 3으로 침입 할 수있는 능력과 함께 연결합니다.
_content는 "유리 coverslips에 코팅 염료 표시 매트릭스 단백질을 사용하여 형광 현미경에 의한 세포의 invadopodia로 인한 ECM 저하의> 시각화는 매트릭스 proteolysis 및 셀룰러 침해 가능성 4,5의 정도를 평가하기위한 가장 널리 기술로 떠오르고있다. 여기에 언급 된 상업적으로 이용 가능한 오레곤 그린 – 488 젤라틴의 공액을 활용 휘황 라벨이 표시된 유리 coverslips을 생성하기위한 표준 방법의 버전입니다.이 방법은 쉽게 빠르게 코팅 coverslips 많은 수의 생산 조정됩니다. 우리는 흔히 발생하는 일반적인 미세 유물의 일부를 보여 이 절차를 수행하는 동안 얼마나 이것들은 방지 할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 개별 셀 의해 전체 휴대폰 인구에 의해 중재 표시 젤라틴 매트릭스 저하의 정량화 할 수 있도록 즉시 사용할 수 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 표준화 된 방법을 설명합니다. 설명 절차는 정확하고 reproducibly 모니터링 할 수있는 기능을 제공 invadopodia활동, 또한 변조 단백질의 발현 또는 단일 및 다세포 설정에서 세포 외 기질 저하에 반 침해 화합물의 테스트의 효능을 평가하기위한 플랫폼으로 제공 할 수 있습니다.Protocol
1. 오레곤 그린 생산은 488 – 젤라틴 코팅 Coverslips 1.25 g 젤라틴 50 ML의 최종 볼륨에 PBS에 1.25 g의 자당을 추가하여 레이블이 지정되지 않은 5% (w / w) 주식 젤라틴 / 자당 솔루션을 준비합니다. 37 ° C에 주식 젤라틴 용액을 따뜻하게하고는 완전히 사용하기 전에 녹을 확인합니다. 4 ° C.에서 최종 혼합물을 저장 24 잘 플라스틱 조직 배양 플레이트의 각도에 개인 coverslip을 배치하여 13mm 직?…
Discussion
세포 외 기질 굴욕 세포를 시각화 할 수있는 능력은 세포 침략의 초기 단계에서 사용 된 분자 메커니즘을 발견에서 도왔습니다. 1980 년대 초 4,14,15에 웬 – 티엔 첸에 의해 개척 이후 미세 분석을위한 유리 coverslips에 코팅 휘황 표시 세포 단백질은 세포 유형의 다양한 범위에 걸쳐 invadopodia 기능을 평가의 기본 기술로 떠오르고있다. 소정의 프로토콜이 일에 비슷한 기존의 형광 및 공 촛점 현…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 웨스트 버지니아 대학의 메리 Babb 랜돌프 암 센터에서 기금 기금에 의해 지원되었다. 우리는 초기 조언과 도움을 Susette 뮐러 (조지 타운 대학교 (Georgetown University))와 로라 켈리 감사드립니다. 웨스트 버지니아 대학 현미경 영상 시설의 사용은 (메리 Babb 랜돌프 암 센터 및 NIH 보조금 P20 RR16440, P30 RR032138와 P30 GM103488에서 지원) 굉장히 인정하고 있습니다.
Materials
| Name of Reagent/Instrument | Company | Catalogue Number | Comments |
| gelatin | Sigma | G1890 | Porcine skin |
| sucrose | Fisher | BP220 | |
| 12 mm coverslips | Fisher | 50-121-5159 | |
| 24 well plates | Fisher | 08-772-1 | BD Falcon |
| nitric acid | Ricca | R5326000 | 20% solution |
| poly-L-lysine | Electron Microscopy Sciences | 19320-B | 0.1% solution |
| glutaraldehyde | Sigma | G7526 | 8% solution |
| Oregon Green 488-conjugated gelatin | Invitrogen | G-13186 | |
| sodium borohydride | Sigma | 213462 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | |
| rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| anti-cortactin (clone 4F11) | Millipore | 05-180 | |
| Anti-FLAG antibody | Millipore | MAB3118 | |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A21235 | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| LSM 510 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| AutoQuant X2.2 software | Media Cybernetics | ||
| NIS Elements software | Nikon |
References
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Citer Cet Article
Martin, K. H., Hayes, K. E., Walk, E. L., Ammer, A. G., Markwell, S. M., Weed, S. A. Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts. J. Vis. Exp. (66), e4119, doi:10.3791/4119 (2012).