Количественное измерение Invadopodia-опосредованного протеолиза внеклеточной матрицы в одно-и многоклеточных контексты
Summary
Мы описываем прототип способ получения микроскопом покровные покрыта флуоресцентной желатина для визуализации invadopodia-опосредованной деградации матрице. Вычислительные методы с использованием доступного программного обеспечения представлены для количественного определения результирующего уровня матрицы протеолиза одной клетки в смешанной популяции и для многоклеточных группы охватывает весь микроскопических полей.
Abstract
Сотовый вторжения в местных тканей является важным процессом в развитии и гомеостаза. Malregulated вторжения и последующего движения клетки характерно несколько патологических процессов, в том числе воспаление, сердечно-сосудистые заболевания и метастазов опухолевых клеток 1. Сосредоточен деградации протеолитическими внеклеточного матрикса (ECM) компонентов в эпителиальной или эндотелиальной базальной мембраны является важным шагом в налаживании сотовой вторжения. В опухолевых клетках, обширный анализ в лабораторных установила, что ECM деградации осуществляется вентральной актина богатых мембранных структур называют выступающими invadopodia 2,3. Invadopodia форме в тесном прикладывание к ECM, где они отвечают ECM пробоя под действием матриксных металлопротеиназ (ММП). Способность опухолевых клеток с образованием invadopodia прямо коррелирует со способностью вторгаться в местные стромы и связанные с ними сосудистые компоненты 3.
_content "> Визуализация invadopodia ECM-опосредованной деградации клеток с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием красителей-меченых белков матрицы наносится на стекло покровные стала наиболее распространенной техникой для оценки степени протеолиза матрицы и сотовые инвазивный потенциал 4,5. Здесь мы опишем версия стандартный метод генерации флуоресцентно-меченных покровные стекла с использованием коммерчески доступных Орегон Зеленый-488 желатином сопряжены. этот метод легко масштабируется быстро производить большое количество покрытием покровные. Покажем некоторые общие микроскопические артефакты, которые часто встречаются Во время этой процедуры и как их можно избежать. Наконец, мы опишем стандартные методы использования доступны компьютерные программы, чтобы количественное меченых желатин деградации матрицы опосредовано отдельных клеток и целых клеточных популяций. описанные процедуры дают возможность точно и воспроизводимо мониторинг invadopodiaдеятельности, а также может служить в качестве платформы для оценки эффективности модуляции экспрессии белка или тестирование по борьбе с инвазивными соединений на деградацию внеклеточных матриц в одно-и многоклеточных настройки.Protocol
Discussion
Способность визуализировать клетки унижающие внеклеточного матрикса помог в раскрытии молекулярных механизмов, занятых в ранних стадиях клеточного вторжения. Pioneered Вэнь-тянь Chen в начале 1980-х годов 4,14,15, покрытием флуоресцентно меченых белков внеклеточного на стекло покровные д…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана благотворительные фонды из Университета Западной Вирджинии Мария Babb Randolph онкологический центр. Мы благодарим Susette Мюллер (Georgetown University) и Лора Келли для ранней консультации и помощь. Использование West Virginia University фонда изображений микроскопии (при поддержке Марии Babb Randolph онкологический центр и, NIH гранты RR16440 P20, P30 и P30 RR032138 GM103488) с благодарностью.
Materials
| Name of Reagent/Instrument | Company | Catalogue Number | Comments |
| gelatin | Sigma | G1890 | Porcine skin |
| sucrose | Fisher | BP220 | |
| 12 mm coverslips | Fisher | 50-121-5159 | |
| 24 well plates | Fisher | 08-772-1 | BD Falcon |
| nitric acid | Ricca | R5326000 | 20% solution |
| poly-L-lysine | Electron Microscopy Sciences | 19320-B | 0.1% solution |
| glutaraldehyde | Sigma | G7526 | 8% solution |
| Oregon Green 488-conjugated gelatin | Invitrogen | G-13186 | |
| sodium borohydride | Sigma | 213462 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | |
| rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| anti-cortactin (clone 4F11) | Millipore | 05-180 | |
| Anti-FLAG antibody | Millipore | MAB3118 | |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A21235 | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| LSM 510 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| AutoQuant X2.2 software | Media Cybernetics | ||
| NIS Elements software | Nikon |
References
- Ridley, A. J. Life at the leading edge. Cell. 145, 1012-1022 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The ‘ins’ and ‘outs’ of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. , (2010).
- Chen, W. T., Chen, J. M., Parsons, S. J., Parsons, J. T. Local degradation of fibronectin at sites of expression of the transforming gene product pp60src. Nature. 316, 156-158 (1985).
- Artym, V. V., Zhang, Y., Seillier-Moiseiwitsch, F., Yamada, K. M., Mueller, S. C. Dynamic interactions of cortactin and membrane type 1 matrix metalloproteinase at invadopodia: defining the stages of invadopodia formation and function. Cancer Res. 66, 3034-3043 (2006).
- Ayala, I., et al. Multiple regulatory inputs converge on cortactin to control invadopodia biogenesis and extracellular matrix degradation. J. Cell Sci. , (2008).
- Ammer, A. G., et al. Saracatinib impairs head and neck squamous cell carcinoma invasion by disrupting invadopodia function. J. Cancer Sci. Ther. 1, 52-61 (2009).
- Seals, D. F., et al. The adaptor protein Tks5/Fish is required for podosome formation and function, and for the protease-driven invasion of cancer cells. Cancer Cell. 7, 155-165 (2005).
- Yamaguchi, H., et al. Molecular mechanisms of invadopodium formation: the role of the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin. J. Cell Biol. 168, 441-452 (2005).
- Kopp, P., et al. The kinesin KIF1C and microtubule plus ends regulate podosome dynamics in macrophages. Mol. Biol. Cell. 17, 2811-2823 (2006).
- Oser, M., et al. Cortactin regulates cofilin and N-WASp activities to control the stages of invadopodium assembly and maturation. J. Cell. Biol. 186, 571-587 (2009).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
- Kelley, L. C., et al. Oncogenic Src requires a wild-type counterpart to regulate invadopodia maturation. J. Cell Sci. 123, 3923-3932 (2010).
- Chen, W. T., Singer, S. J. Fibronectin is not present in the focal adhesions formed between normal cultured fibroblasts and their substrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7318-7322 (1980).
- Chen, W. T., Olden, K., Bernard, B. A., Chu, F. F. Expression of transformation-associated protease(s) that degrade fibronectin at cell contact sites. J. Cell Biol. 98, 1546-1555 (1984).
- Bharti, S., et al. Src-dependent phosphorylation of ASAP1 regulates podosomes. Mol. Cell Biol. 27, 8271-8283 (2007).
- Albrechtsen, R., Stautz, D., Sanjay, A., Kveiborg, M., Wewer, U. M. Extracellular engagement of ADAM12 induces clusters of invadopodia with localized ectodomain shedding activity. Exp. Cell Res. 317 (10), 195-209 (2011).
- Scott, R. W., et al. kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells. J. Cell Biol. 191, 169-185 (2010).
- Mueller, S. C., Yeh, Y., Chen, W. T. Tyrosine phosphorylation of membrane proteins mediates cellular invasion by transformed cells. J. Cell. Biol. 119, 1309-1325 (1992).
- Bowden, E. T., Coopman, P. J., Mueller, S. C. Invadopodia: unique methods for measurement of extracellular matrix degradation in vitro. Methods Cell Biol. 63, 613-627 (2001).
- Baldassarre, M., et al. Dynamin participates in focal extracellular matrix degradation by invasive cells. Mol. Biol. Cell. 14, 1074-1084 (2003).
- Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr. Biol. 18, 1295-1299 (2008).
- Artym, V. V., Yamada, K. M., Mueller, S. C. ECM degradation assays for analyzing local cell invasion. Methods Mol. Biol. 522, 211-219 (2009).
- Schoumacher, M., Goldman, R. D., Louvard, D., Vignjevic, D. M. Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of invadopodia. J. Cell Biol. 189, 541-556 (2010).
- Clark, E. S., Whigham, A. S., Yarbrough, W. G., Weaver, A. M. Cortactin is an essential regulator of matrix metalloproteinase secretion and extracellular matrix degradation in invadopodia. Cancer Res. 67, 4227-4235 (2007).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphoinositide 3-kinase signaling pathway mediated by p110alpha regulates invadopodia formation. J. Cell Biol. 193, 1275-1288 (2011).
- Li, A., et al. The actin-bundling protein fascin stabilizes actin in invadopodia and potentiates protrusive invasion. Curr. Biol. 20, 339-345 (2010).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and PIP5-kinase Ialpha are required for invadopodia formation in human breast cancer cells. Cancer Sci. , (2010).
