Summary
Probe-basierte konfokale Laser Endomikroskopie ermöglicht Echtzeit-Mikroskopie des menschlichen Harnwege während Zystoskopie, Bereitstellung dynamischer, intravital Darstellung pathologischer Zustände wie Blasenkrebs mit zellulärer Auflösung. Endomikroskopie kann ergänzen die diagnostische Genauigkeit der Standard-Weißlicht-Endoskopie und bieten intraoperative Bildführung zur chirurgischen Resektion verbessern.
Abstract
Probe-basierte konfokale Laser Endomikroskopie (CLE) ist eine aufstrebende optische Imaging-Technologie, die in Echtzeit ermöglicht in vivo Mikroskopie von Schleimhäuten im Standard-Endoskopie. Mit Anwendungen, die derzeit in den Atemwegen 1 und Gastrointestinaltrakt hat 2-6 CLE auch in den Harnwegen für Blasenkrebs Diagnose untersucht. 7-10 Cellular Morphologie und Gewebe Mikroarchitektur mit Mikrometer-Skala Auflösung in Echtzeit gelöst werden, zusätzlich zu dynamische Bildgebung des normalen und pathologischen Gefäßsystem. 7
Die Sonde basierenden CLE System (Cellvizio, Mauna Kea Technologies, Frankreich) aus einem wiederverwendbaren faseroptische Sonde zur Abbildung, die mit einem 488 nm Laser-Scanning-Einheit. Das bildgebende Sonde in den Arbeitskanälen von Standard flexible und starre Endoskope eingefügt. Ein Endoskop-basierten CLE System (Optiscan, Australien), in dem der konfokale Endomikroskopie functionality auf das Endoskop integriert ist, ist auch im Magen-Darm-Trakt verwendet werden. Angesichts des größeren Umfangs Durchmesser, jedoch ist die Anwendung in den Harnwegen derzeit ex vivo Anwendung begrenzt. 11 Konfokale Bildaufnahme durch den direkten Kontakt des abbildenden Sonde mit dem Ziel-Gewebe durchgeführt und als Videosequenzen. Wie in den Gastrointestinaltrakt, erfordert Endomikroskopie der Harnwege eine exogenenous Kontrastmittel-häufigsten Fluorescein, die intravenös oder intravesikal verabreicht werden kann. Intravesikale Verabreichung ist eine gut etablierte Methode, um pharmakologische Wirkstoffe lokal einzuführen mit minimaler systemischer Toxizität, die einzigartig in der Harnwege. Fluorescein schnell Flecken, die extrazelluläre Matrix und verfügt über ein etabliertes Sicherheitsprofil. 12 Imaging-Sonden mit verschiedenen Durchmessern ermöglichen Kompatibilität mit verschiedenen Kalibers Endoskope. Bisher wurden 1,4 und 2,6 mm Sonden mit flexiblen und ri beurteiltgid Zystoskopie. 10 Aktuelle Verfügbarkeit eines <1 mm Bildgebungssonde 13 eröffnet die Möglichkeit des CLE in der oberen Harnwege während Ureteroskopie. Fluoreszenz Zystoskopie (dh photodynamischen Diagnose) und Schmalband-Imaging sind zusätzliche Endoskop-basierten optischen Abbildungsmodalitäten 14, die mit CLE kombiniert werden, um multimodale Bildgebung der Harnwege erreichen kann. In der Zukunft kann CLE mit molekularem Kontrastmitteln wie fluoreszenzmarkierten Peptiden und Antikörpern für 15 Endoskopabbildungsvorrichtung von Krankheitsprozessen mit molekularem Spezifität gekoppelt sein.
Protocol
Ein. Vorbereitung des Patienten
- Consent Patienten für diagnostische Zystoskopie und andere endourologischen Verfahren wie die transurethrale Resektion der Blase Tumor (TURBT) für CLE geplant. Fügen Sie in der Zustimmung eine Beschreibung der Verwendung von intravesikale und / oder intravenöse Fluorescein als Kontrastmittel. Erkundigen Geschichte der Überempfindlichkeitsreaktion auf Fluorescein.
- Der Patient wird für die Zystoskopie (typischerweise in Steinschnittlage) positioniert und vorbereitet in einem sterilen Mode.
- Fahren Sie mit dem Standard-Weißlicht-Zystoskopie (WLC) mit einem starren oder flexiblen Zystoskop durch die Harnröhre.
- Umfrage alle Regionen der Blase unter weißem Licht (Abbildung 1), und notieren Sie Regionen von Interesse für die CLE Untersuchung.
- Neben WLC kann die Blase mit anderen makroskopischen optischen Bildgebungsverfahren einschließlich Fluoreszenz Zystoskopie (2A) oder Schmalband Bildgebung (2B) zu id abzubildendenentify weitere Bereiche der Verdacht durch Charakterisierung mit CLE gefolgt.
- Verwenden eine Elektrode oder Kauterisierung Resektionsschlinge einen kleinen Kauter Markierung an der interessierenden Bereiche, die sowohl bebildert und für pathologische Bestätigung biopsiert platzieren. Der Kauter mark ermöglicht Re-Lokalisierung für nachfolgende CLE Bildgebung und Biopsie.
2. Kontrastmittel
- Intravesikale Instillation des Kontrastmittels
- Planen durch Verdünnen klinischer Qualität 10% Fluorescein-Natrium in steriler physiologischer Kochsalzlösung (0,9% NaCl) auf die gewünschte Konzentration. Beispielsweise vorzubereiten 400 ml 0,1% Fluorescein durch Verdünnen von 4 ml 10% Fluorescein in 396 ml physiologischer Kochsalzlösung.
- Eine sterile Harnkatheters in die Blase und instill verdünnten Kontrastmittels durch Schwerkraft mit einer 60 ml Spritze Katheterspitze.
- Klemmen Sie den Blasenkatheter, um Kontrastmittel innewohnenden für 5 min zu halten.
- Lassen Sie Kontrastmittel aus der Blase. Verwenden Sie die 60 ml ca.theter-Spitze Spritze zu waschen Restkontrast aus der Blase mit physiologischer Kochsalzlösung, ca. 240-300 ml.
- Fahren Sie mit CLE Bildgebung.
- Intravenöse Injektion von Fluorescein
- Zeichnen Sie 1,0 ml Fluorescein in die Spritze. Spritze zu befestigen intravenösen Zugang und injizieren 0,5 - 1,0 ml des Fluoresceins intravenös als Bolus. Spülleitung mit physiologischer Kochsalzlösung. Dies wird typischerweise durch die Anästhesieteam im Operationssaal erfolgen.
- Fahren Sie mit CLE Bildgebung.
3. CLE Imaging
- Entfernen Sie die sterilisiert CLE-Sonde (Cellvizio) aus der Verpackung und verbinden Sie es mit dem Laser-Scanning-Einheit (Mauna Kea Technologies, Paris, Frankreich)
- Warm up und Kalibrierung des bildgebenden Sonde, indem Sie die Anweisungen des Herstellers.
- Setzen Sie den Zystoskop oder Resektoskop in die Blase. Verwenden Sie eine 0-Grad-Objektiv mit dem starren Zystoskop.
- Schieben Sie den CLE-Sonde entlang der WOrking des Zystoskops mit der Spitze direkt hinter dem Zystoskop.
- Unter weißem Licht, suchen Sie die zuvor markierten Regionen von Interesse. Verwenden zusätzlicher physiologischer Kochsalzlösung Bewässerung zur Visualisierung der Schleimhaut erforderlich und aufrechtzuerhalten moderaten Distension der Blase.
- Manipulieren CLE-Sonde mit der Hand des Bedieners für direkte en face Kontakt der Regionen von Interesse. Für optische Schnitte von den interessierenden Bereichen, sanft zu erhöhen und Druck auf das bildgebende Sonde unter Beibehaltung direkten Kontakt.
- Tumore an der anterioren Blase zu erreichen, kann ein Standard Albarran Brücke erleichtern Auslenkung der Bildgebungssonde für direkten Kontakt mit dem interessierenden Bereich (2C).
- Gemeinsame Regionen von Interesse sind papillären Tumor, nicht-papillären Tumor Übergang zwischen normal erscheinenden Schleimhaut und Tumor und gerötete Flecken, die alle abgebildet werden können, die entweder intravenös werdensischen oder intravenöse Fluorescein Verwaltung. Intravenöse Fluorescein ist zum Abbilden der Resektion Bett, prostatische Urethra und penile Harnröhre erforderlich.
- Da die bildgebenden Sonde tastet Region von Interesse, die Aufnahme von Bildern für eine spätere Analyse. Hinweis gesamten zellulären Morphologie, Grenze, Organisation und Präsenz von Neo-Angiogenese.
- Nach Abschluss der Bildgebung, entfernen CLE-Sonde von der Arbeit Kanal.
- Wenn gewünscht, erhalten kalt-cup Biopsien aus entsprechenden Regionen von Interesse, die von CLE gescannt wurden. Verwenden Kauter Markierungen als Landmarken für Co-Registrierung der abgebildeten Bereiche, die biopsiert.
- Füllen TURBT pro Routine. Bei Patienten, die intravenöse Fluorescein erhalten, sollten Sie kontinuierlichen Resektoskopen zur Visualisierung während der Resektion zu verbessern, wie Fluorescein wird von der Niere in die Blase ausgeschieden ca. 5 min nach intravenöser Verabreichung.
- Rufen Sie gespeicherte Bild Aufnahmen von konfokalen Prozessor und Breitenwirkungct Bildanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CLE Bilder gespeichert werden als Video-Sequenz-Dateien Graustufen bei 12 Frames pro Sekunde. Bild Interpretation wird in Echtzeit und kann verwendet werden, um die klinische Entscheidungsfindung im Rahmen einer experimentellen Protokoll auswirken werden. Offline-Analyse, die der Überprüfung der Videosequenz, zusätzliche Bildverarbeitung wie Mosaiken, 7 und Vergleich mit Standard-Pathologie beinhaltet, die während der Lernphase Phase mit der Technologie verbunden wichtig. 1B und 1C sind Darstellungen CLE Bilder von zwei verschiedenen Blasentumoren Verwendung intravesikale und intravenöse Fluorescein, erhalten. Für Blasentumoren, zelluläre Funktionen (z. B. Morphologie, den Zusammenhalt und die Grenzen) und Mikroarchitektur Funktionen (zB flache gegenüber papilläre Tumore, Gewebe Organisation und vaskulären Funktionen) werden notiert, um zwischen benignen und malignen Läsionen und niedrigen und hohen Grad Krebs zu unterscheiden. Angesichts der Imaging-Sonden kann zwischen verschiedenen typ vertauschtes der Zystoskopen können CLE mit anderen Schwellenländern Bildgebungsverfahren einschließlich Fluoreszenz Cystoskopie (2A) und Narrow Band Imaging (2B), die die diagnostische Genauigkeit der beiden Technologien von selbst verbessern können kombiniert werden.
Abbildung 1. Vertreter Bilder von WLC und CLE abhängig intravesikale gegenüber intravenöser Verabreichung von Fluorescein. A. WLC mit intravesikal gebeizt papillären Tumor. 2.6-mm Bildgebungssonde sichtbar im unteren Bereich des Bildes. B. CLE der intravesikal gebeizt papillären Tumor. C. CLE von intravenös gebeizt papillären Tumor. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 2. Zusatztherapie makroskopischen bildgebenden Modalitäten und zusätzliche Werkzeuge. A. CLE Imaging in Verbindung mit Fluoreszenz Zystoskopie (mit der Verabreichung von hexaminolevulinate Hydrochlorid). CLE-Sonde sichtbar ist auf der linken Seite des Bildes. B. CLE Bildgebung in Verbindung mit Narrow Band Imaging. CLE-Sonde sichtbar ist auf der linken Seite des Bildes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Erreichen und Aufrechterhalten festen en face Kontakt zwischen der Sonde zur Abbildung und der Blasenschleimhaut ist der wichtigste Schritt in Erfassen optimaler Bildqualität. Es ist etwa 3-5 Patienten Lernkurve, um die Geschicklichkeit zu entwickeln, um die bildgebende Sonde zu manipulieren und zu halten die Sonde konstant während der Bildaufnahme. Darüber, wie dieses Verfahren in vivo durchgeführt wird, kann Bewegungen des Patienten (dh der Atemwege) und vaskuläre Pulsationen auf die bildgebende Sonde Kontakt mit der Blase. Die Interobserver Varianz und die Lernkurve der Bildinterpretation, die Erfahrung mit breitem Blase Pathologie erfordert, werden derzeit untersucht. Variation in der Bildqualität kann das Gewebe Variabilität und zugrunde liegende Pathologie zurückgeführt werden. Abbilden der normalen Bereichen neben den verdächtigen erscheinenden Bereichen, ist nützlich, um die Bildqualität und Fluorescein-Färbung bewerten.
Kauter marking jeder Region von Interesse ist hilfreich bei der Erleichterung Relokalisierung der bebildert und operativ entfernte Gewebe, wie die Blase entleert und wiederholt zwischen Bildaufnahme und Resektion nachgefüllt. Dieser Schritt, genannt Co-Registrierung ist für die vergleichende Analyse wichtig, Bilder mit CLE mit der Histologie korrelieren. Beide Verfahren für intravesikale und intravenöser Verabreichung von Fluorescein sind oben mit einigen Unterschieden in Bezug auf Timing und Voraussetzung für ein intravenöser Zugang beschrieben. 8
Abhängig von der anatomischen Lage und mikroskopischen abzubildenden, dem optimalen Modus und des Zeitpunkts der Verabreichung Fluorescein muss experimentell ermittelt werden. Bei Patienten, die intravesikale Fluorescein empfangen können zusätzliche intravenöse Verabreichung an Fluorescein Bild die Bereiche, die nicht gefärbten (zB Tumorbett, Harnröhre) gegeben werden.
Ein 2,6 mm-Sonde wurde in diesem DEM verwendetonstration. Jedoch könnte der Zugriff auf das Prinzip der Blase mit Sonde-basierte Technologie in zukünftigen Generationen von bildgebenden Sonden, die Bildqualität in kleinere und leichter zu steuern Sonden erweitern ausgenutzt werden. Bildgebungssonden 1 mm Durchmesser wurden vor kurzem beschrieben. 13 Diese kleineren Bildgebungssonden kann CLE Bildgebung in der ambulanten Zystoskopie sowie in vivo konfokale Abbildung der oberen Harnwege während Ureteroskopie ermöglichen.
Schließlich können neuartige Kontrastmittel spezifischen Blasenkrebs entwickelt, verbessert die Bildqualität werden. Die Technik der Einträufeln Kontrastmittel gezeigt intravesikal erheblichem Umfang hält Versprechen, da der Patient hat eine geringere Risiko für systemische Exposition im Vergleich zur intravenösen Injektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Mauna Kea Technologies für technische Unterstützung danken. Die Autoren danken Shelly Hsiao für technische Hilfe und Kathleen E. Mach für kritische Bewertung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch NIH R01CA160986 um JCL unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellvizio 100 Series | Mauna Kea Technologies | 100 Series | Includes confocal processor and LSU: F400-v2 at 488 nm |
| Cellvizio Confocal Miniprobe | Mauna Kea Technologies | Gastroflex UHD | |
| AK-FLUOR 10% | Akorn, Inc. | NDC 17478-253-10 |
References
- Thiberville, L., et al. Human in vivo fluorescence microimaging of the alveolar ducts and sacs during bronchoscopy. Eur. Respir. J. 33, 974-985 (2009).
- Dunbar, K. B., Okolo, P. 3rd, Montgomery, E., Canto, M. I. Confocal laser endomicroscopy in Barrett's esophagus and endoscopically inapparent Barrett's neoplasia: a prospective, randomized, double-blind, controlled, crossover trial. Gastrointest. Endosc. 70, 645-654 (2009).
- Buchner, A. M., et al. Comparison of probe-based confocal laser endomicroscopy with virtual chromoendoscopy for classification of colon polyps. Gastroenterology. 138, 834-842 (2010).
- Pech, O., et al. Confocal laser endomicroscopy for in vivo diagnosis of early squamous cell carcinoma in the esophagus. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 6, 89-94 (2008).
- Goetz, M., et al. In vivo confocal laser endo microscopy of the human liver: a novel method for assessing liver microarchitecture in real time. Endoscopy. 40, 554-562 (2008).
- Meining, A., et al. Detection of cholangiocarcinoma in vivo using miniprobe-based confocal fluorescence microscopy. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 6, 1057-1060 (2008).
- Wu, K., et al. Dynamic real-time microscopy of the urinary tract using confocal laser endomicroscopy. Urology. 78, 225-231 (2011).
- Sonn, G. A., et al. Optical biopsy of human bladder neoplasia with in vivo confocal laser endomicroscopy. J. Urol. 182, 1299-1305 (2009).
- Sonn, G. A., et al. Fibered confocal microscopy of bladder tumors: an ex vivo study. J. Endourol. 23, 197-201 (2009).
- Adams, W., et al. Comparison of 2.6- and 1.4-mm imaging probes for confocal laser endomicroscopy of the urinary tract. J. Endourol. 25, 917-921 (2011).
- Wiesner, C., et al. Confocal laser endomicroscopy for the diagnosis of urothelial bladder neoplasia: a technology of the future? BJU Int. 107, 399-403 (2011).
- Wallace, M. B., et al. The safety of intravenous fluorescein for confocal laser endomicroscopy in the gastrointestinal tract. Aliment. Pharmacol. Ther. 31, 548-552 (2010).
- Konda, V. J. A., et al. First assessment of needle-based confocal laser endomicroscopy during EUS-FNA procedures of the pancreas (with videos. Gastrointest. Endosc. 74, 1049-1060 (2011).
- Liu, J. -J., Droller, M., Liao, J. C. New Optical Imaging Technologies in Bladder Cancer: Considerations and Perspectives. J. Urol. 188, 361-368 (2012).
- Hsiung, P. -L., et al. Detection of colonic dysplasia in vivo using a targeted heptapeptide and confocal microendoscopy. Nat. Med. 14, 454-458 (2008).
