العزلة والثقافة، وتوصيف وظيفي من الكبار ماوس Cardiomyoctyes
Summary
نحن هنا وصف عزلة cardiomyoctyes فأر بالغ باستخدام نظام نضح Langendorff. الخلايا الناتجة CA2 +-تسامحا، هادئة كهربائيا ويمكن أن يكون مثقف وtransfected مع-الغدة أو lentiviruses للتلاعب الجيني. ويمكن أيضا تحليل وظائفها باستخدام نظام MMSYS وتقنيات المشبك التصحيح.
Abstract
وقد وفرت استخدام العضلية الأولية (CMS) في الثقافة تكملة قوية لنماذج الفئران من أمراض القلب في دفع فهمنا لمرض القلب. على وجه الخصوص، وقد أدت القدرة على دراسة توازن الأيوني، وظيفة القناة الايونية، استثارة الخلوية والإثارة، تقلص اقتران والتعديلات في ظروف المريضة والطفرات المسببة للمرض إلى رؤى كبيرة في أمراض القلب. علاوة على ذلك، فإن عدم وجود خط الخلية كافية لتقليد الكبار خلد مضادة، والقيود المفروضة على الأطفال حديثي الولادة مضادة (التي تفتقر إلى العديد من الخصائص الميكانيكا الحيوية الهيكلية والوظيفية من الكبار CMS) في الثقافة أعاقت فهمنا للتفاعل معقد بين مسارات الإشارات، القنوات الأيونية وخصائص مقلص في قلب الكبار تعزيز أهمية دراسة الكبار العضلية معزولة. هنا، فإننا نقدم طرق لعزل والثقافة، والتلاعب في التعبير الجيني عن طريق الغدانية-expreالبروتينات ssed، وتحليل وظيفي لاحقة من العضلية من الماوس الكبار. فإن استخدام هذه التقنيات تساعد على تطوير البصيرة الآلي في مسارات الإشارات التي تنظم استثارة الخلوية، كا 2 + ديناميات وانقباض وتوفير توصيف أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية الكثير من أمراض القلب والشرايين.
Introduction
خدموا نماذج الفئران من مرض القلب والأوعية الدموية كأدوات فعالة لتوضيح الآليات الأساسية المرض 1،2 فضلا عن تحديد الأهداف العلاجية المحتملة 1،3. على وجه الخصوص، واستخدام كلا النموذجين الفئران من أمراض القلب المكتسبة (مثل الضغط الزائد) 4،5 ونماذج الماوس المعدلة وراثيا قد تقدم فهمنا لمرض القلب 6-8. استخدام تقنيات زراعة الخلايا لدراسة الإشارات شلالات 3،9،10 وتغييرات في البروتينات الفردية التي تكمن وراء استثارة الخلوية والإثارة، تقلص اقتران في قلب 11-13 على مستوى خلية واحدة ويكمل في الجسم الحي نماذج الماوس. ومع ذلك، فإن عدم وجود خطوط الخلايا الكافية التي تعكس هيكل CM الكبار وظيفة جود قيود كبيرة. وقد سعى المحققون للتغلب على هذا من خلال دراسة البروتينات الفردية، مثل القنوات الأيونية، في أنظمة تعبير مغايرة <suص 14>، وبينما قدمت هذه الدراسات لنا معلومات مفيدة من حيث الفيزياء الحيوية القناة الايونية أو الاتجار البروتين، والتمثيل غير الكافي للالمكروية مواليد مضادة وجود قيود كبيرة. وثانيا، لأن معظم هذه الخلايا مغاير لم يكن لديك جهاز مقلص ناضجة، لم يكن من الممكن لدراسة وظيفة مقلص والتفاعل المعقد بين استثارة الخلوية والانكماش. لهذا السبب، تحولت الباحثين لمزارع الخلايا القلبية الأساسية للعديد من الدراسات في المختبر وظيفية. أخيرا، والدراسات cardiomyocyte معزولة تسمح بتقييم وظيفة مقلص دون عوامل خارجية متعددة الخلايا من إعداد بما في ذلك أثر ندبة أو تليف واتجاه الألياف.
وسهلة نسبيا للثقافة، يمكن أن يصاب الأطفال حديثي الولادة العضلية البطين الفئران الابتدائي (NRVMs) مع الفيروسات الغدية وlentiviruses للتلاعب التعبير الجيني 15، والثانية تم لذا استخدمت بنجاح 1، ولكن لديها قيود خاصة بهم. على الرغم من أنها توفر المكروية الفسيولوجية 1 وكانت العمود الفقري للحقل الإشارات، اختلافات جوهرية بين التشكل وتنظيم التحت خلوية من NRVMs وcardiomyoctyes الكبار جعلها نموذجا غير كافية للتحقيق في تدفقات الأيونية والإثارة، تقلص اقتران في قلب الكبار . أبرزها NRVMs تفتقر إلى نهائي تي أنبوبي الفرعي 4. منذ كا 2 + تدفق وديناميكية تعتمد بشكل حاسم على ناضجة تي أنبوبي وشبكية الهيولى العضلية (SR) هيكل 6، كا 2 + ديناميات والدراسات الفنية التابعة للانقباض القلب في NRVMs ليست انعكاسا دقيقا لهذه العمليات الحرجة في العضلية الكبار. علاوة على ذلك، بعض مكونات مسارات الإشارات تختلف بين الأطفال حديثي الولادة والكبار الفئران 9، وبالتالي توفير الحد أخرى لدراسة عمليات المرض وأنا علىMPACT على استثارة الخلوية وانقباض في NRVMs. أخيرا، وتوزيع آلات مقلص يؤدي إلى متعدد الاتجاهات وغير موحدة تقصير الخلايا مما يحد من دقة القياسات مقلص.
وبالتالي فإن استخدام العضلية الكبار معزولة يوفر أكثر دقة في المختبر نظام النمذجة. نمو استثنائية من المعرفة الذي أصبح ممكنا بفضل التلاعب الجيني للفئران يؤكد أهمية الحصول العضلية المعزولة من الفئران وظيفية. في الواقع، فإن توصيف مضادة الكبار معزولة عن نماذج الماوس وتسليط الضوء على العديد من الأحداث البيولوجية والمرضية. وقد سمحت مضادة معزولة عن نماذج الماوس المعدلة وراثيا للدراسات من ربح أو خسارة وظيفة من البروتينات مقلص على خصائص الخلايا واحدة 2،16، وقدرتها على البقاء في نماذج الأمراض مثل نقص التروية / ضخه 17،18، وبالتالي استكمال المعلومات المكتسبة من في الدراسات المجراة علىالفئران حد ذاتها. استخدام الكبار معزولة مضادة من نماذج الفئران من أمراض القلب المكتسبة 3،19،20 (مثل عرضية الأبهر الناجم عن انقباض الضغط الزائد، الذي يحاكي ارتفاع ضغط الدم أو تضيق الأبهر صمام) أو ممارسة 5،21 (لنمذجة تضخم الفسيولوجية) يسمح للفحص تفاعل يشير شلالات المتورطين في هذه العمليات مع استثارة الخلوية والإثارة، تقلص اقتران على مستوى خلية واحدة. وعلاوة على ذلك، والقدرة على التعامل مع التعبير الجيني باستخدام يحركها الغدانية التعبير الجيني في الكبار مضادة يتيح لنا الفرصة لتشريح مكونات مسارات الإشارات المعقدة.
من وجهة نظر الكهربية، وقد تم الجهد خلية كاملة والتجارب المشبك الحالي على الكبار معزولة مضادة حاسمة في توضيح طبيعة التدفقات الأيونية في الأساس وفي مختلف الحالات المرضية. بسبب بنية معقدة من الأغشية الخلوية والمتواجد التفاضليةفي هياكل السقالات بين الكبار مضادة وNRVMs أو خطوط الخلايا مغاير، والقدرة على التصحيح خلايا بالغة يعطي تمثيل أفضل بكثير من آثار بعض البروتينات الغشاء، والبروتينات الهيكلية، والقناة الايونية شركاء التفاعل على المكونات الكهربية للقلب الكبار.
على الرغم من هذه المزايا البارزة في دراسة الكبار العضلية الفئران وعزل وزراعة العضلية الفئران تم تحدي، وحث على ضرورة وصف منظم ودقيق للمنهجية عزل العضلية الماوس قابلة للحياة والمحافظة عليها في الثقافة للسماح مزيد من التلاعب الجيني باستخدام الفيروسية ناقلات. وقد استخدمت الدراسات السابقة إما معزولة تماما الكبار الماوس مضادة أو مستنبت الكبار الفئران مضادة. هذه الأخيرة هي أسهل للثقافة من الماوس الكبار سم، واستخدمت معظم التجارب التلاعب التعبير الجيني في المختبر الفئران الكبار مضادة. غيرت بنجاح قليل من الدراسات والتحقيق الوظائالتعبير الجيني اونال في الماوس الكبار مضادة، وتقديم الحد الكبيرة في نطاق التجارب. وبالتالي، فإننا نقدم هنا في التفاصيل هذه المنهجيات، معدلة من التحقيقات السابقة، لعزل 7،8،22 والثقافة 3،10،15،23، عدوى الفيروسة الغدانية 11-13،15، والتحليل الوظيفي من الماوس الكبار cardiomyoctyes البطين. هذه النتائج بروتوكول العزلة في كا 2 +-تسامحا، منفعل العضلية التي لدينا مثقف بنجاح لمدة تصل إلى 72 ساعة وعابر مع اتش. وظيفة هذه الخلايا معزولة يمكن تقييمها باستخدام نظام التصوير MMSYS 14،24 والمشبك التصحيح، والتي ستناقش أيضا.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا التقرير، وصفناها التقنيات اللازمة لعزل ناجحة وثقافة الكبار مضادة من القلب الماوس. أسلوبنا يسمح لدراسة لاحقة من وظيفة CM واستثارة باستخدام الأساليب المذكورة أعلاه. المعلمة الحرجة لدراسة وظيفة من الكبار مضادة هي الصحة ونوعية مضادة معزولة. كما هو موضح أعلاه، لدي…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282 | |
| D-glucose minimum | Sigma | G8270 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma | B0752 | |
| Collagenase B | Roche Applied Science | 11088807001 | |
| Collagenase D | Roche Applied Science | 11088858001 | |
| Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma | A2153 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C8106 | |
| Minimum Essential Media | Sigma | 51411C | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | |
| L-glutamine | Sigma | G3126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I1884 | |
| Cesium Chloride | Sigma | 289329 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Cesium Hydroxide Solution | Sigma | 232041 | |
| Tetraethylammonium hydroxide solution | Sigma | 86643 | |
| OptiVisor optical glass binocular visor | Dohegan Optical Company Inc. | N/A | |
| Tissue forceps, 5.5″, 1×2 teeth | Roboz Scientific | RS-8164 | |
| Moloney forceps – 4.5″ (11.5 cm) long slight curve, serrated | Roboz Scientific | RS-8254 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm | Roboz Scientific | RS-4966 | |
| Packer Mosquito Forceps 5″ Straight Flat | Roboz Scientific | RS-7114 | |
| Micro Dissecting Scissors 4.5″ Curved Sharp/Sharp | Roboz Scientific | RS-5917 | |
| Micro Dissecting Scissors 3.5″ Straight Sharp/Sharp20mm | Roboz Scientific | RS-5907 |
References
- Chlopcikova, S., Psotová, J. Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart. Biomedical Papers. , (2001).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat. Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
- Ballou, L. M., Lin, R. Z. Rapamycin and mTOR kinase inhibitors. J. Chem. Biol. 1, 27-36 (2008).
- Brette, F., Orchard, C. T-Tubule Function in Mammalian Cardiac Myocytes. Circ Res. , (2003).
- Sakata, Y., Hoit, B., Liggett, S., Walsh, R. Decompensation of pressure-overload hypertrophy in G?q-overexpressing mice. Circulation. , (1998).
- Lieu, D. K., et al. Absence of Transverse Tubules Contributes to Non-Uniform Ca 2+Wavefronts in Mouse and Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells and Development. 18, 1493-1500 (2009).
- Lim, H., De Windt, L., Mante, J., Kimball, T. Reversal of cardiac hypertrophy in transgenic disease models by calcineurin inhibition. J. Mol. Cell Cardiol. 32 (4), 697-709 (2000).
- Muthuchamy, M., et al. Mouse model of a familial hypertrophic cardiomyopathy mutation in alpha-tropomyosin manifests cardiac dysfunction. Circ. Res. 85, 47-56 (1999).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. J. Mol. Cell. Cardiol. 34, 807-821 (2002).
- Epstein, F., Hunter, J. Signaling pathways for cardiac hypertrophy and failure. New England Journal of Medicine. 341 (17), 1276-1283 (1999).
- Snopko, R., Aromolaran, A., Karko, K. Cell culture modifies Ca 2+ signaling during excitation-contraction coupling in neonate cardiac myocytes. Cell Calcium. , (2007).
- Ranu, H., Terracciano, C., Davia, K. Effects of Na+/Ca2+-exchanger overexpression on excitation-contraction coupling in adult rabbit ventricular myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 34 (4), 389-400 (2002).
- Kaab, S., Nuss, H. B., Chiamvimonvat, N., O’Rourke, B., Pak, P. H., Kass, D. A., Marban, E., Tomaselli, G. F. Ionic mechanism of action potential prolongation in ventricular myocytes from dogs with pacing-induced heart failure. Circ. Res. 78 (2), (1996).
- Splawski, I., et al. Variant of SCN5A sodium channel implicated in risk of cardiac arrhythmia. Science. 297, 1333-1336 (2002).
- Zhou, Y., Wang, S., Zhu, W. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279 (1), 429-436 (2000).
- Sussman, M., Lim, H., Gude, N., Taigen, T. Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition. Science. , (1998).
- Heinzel, F. R., et al. Impairment of diazoxide-induced formation of reactive oxygen species and loss of cardioprotection in connexin 43 deficient mice. Circ. Res. 97, 583-586 (2005).
- Li, X., Heinzel, F. R., Boengler, K., Schulz, R., Heusch, G. Role of connexin 43 in ischemic preconditioning does not involve intercellular communication through gap junctions. J. Mol. Cell. Cardiol. 36, 161-163 (2004).
- Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J., Chein, K. R. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).
- Nakamura, A., Rokosh, D. LV systolic performance improves with development of hypertrophy after transverse aortic constriction in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281 (3), 1104-1112 (2001).
- Boström, P., et al. A PGC1-?-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis. Nature. 481, 463-468 (2012).
- Liao, R., Jain, M. Isolation, culture, and functional analysis of adult mouse cardiomyocytes. Methods Mol. Med. 139, 251-262 (2007).
- Volz, A., Piper, H. M., Siegmund, B., Schwartz, P. Longevity of adult ventricular rat heart muscle cells in serum-free primary culture. J. Mol. Cell. Cardiol. 23, 161-173 (1991).
- Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. -. S. . Methods in Molecular Biology. 689, 205-214 (2010).
- Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. (47), e2269 (2011).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (20), e936 (2008).
- Arman, A. C., Sampath, A. P. Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation. J. Vis. Exp. (43), e2107 (2010).
- Wen, H., Brehm, P. Paired patch clamp recordings from motor-neuron and target skeletal muscle in zebrafish. J. Vis. Exp. (45), e2351 (2010).
- Maier, S., Westenbroek, R. An unexpected role for brain-type sodium channels in coupling of cell surface depolarization to contraction in the heart. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (6), 4073-4078 (2002).
- Shroff, S. G., Saner, D. R., Lal, R. Dynamic micromechanical properties of cultured rat atrial myocytes measured by atomic force microscopy. Am. J. Physiol. 269, 286-292 (1995).
- Domke, J., Parak, W. J., George, M., Gaub, H. E., Radmacher, M. Mapping the mechanical pulse of single cardiomyocytes with the atomic force microscope. European Biophysics Journal. 28, 179-186 (1999).
- Smith, B. A., Tolloczko, B., Martin, J. G., Grütter, P. Probing the Viscoelastic Behavior of Cultured Airway Smooth Muscle Cells with Atomic Force Microscopy: Stiffening Induced by Contractile Agonist. Biophysical Journal. 88, 2994-3007 (2005).
