Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung der erwachsenen Maus Cardiomyoctyes
Summary
Hier beschreiben wir die Isolierung von adulten Maus cardiomyoctyes mit einem Langendorff-Perfusion-System. Die resultierenden Zellen sind Ca2 +-tolerant, elektrisch Ruhe und kultiviert und mit Adeno-oder Lentiviren, um die Genexpression zu manipulieren transfiziert werden. Ihre Funktionalität kann auch mit dem MMSYS System und Patch-Clamp-Techniken analysiert werden.
Abstract
Die Verwendung von primären Kardiomyozyten (CMS) in der Kultur hat eine leistungsstarke Ergänzung zu Mausmodellen von Herzerkrankungen in unser Verständnis von Herzerkrankungen ist. Insbesondere haben die Fähigkeit, Ionen-Homöostase, Ionenkanal-Funktion, Mobil Erregbarkeit und Erregung und Kontraktion Kupplung und deren Veränderungen in erkrankten Bedingungen und durch krankheitsverursachende Mutationen zu studieren, um wichtige Erkenntnisse zu Herzerkrankungen geführt. Darüber hinaus haben der Mangel an einer angemessenen immortalisierten Zelllinie zu Erwachsenen CMs imitieren, und die Grenzen der Neugeborenen-CMs (die viele der strukturellen und funktionellen Biomechanik Merkmal der Erwachsenen fehlt CMs) Kultur in unserem Verständnis der komplexen Zusammenspiel zwischen Signalwege behindert, Ionenkanäle und kontraktilen Eigenschaften im erwachsenen Herzen Stärkung der Bedeutung des Studiums Erwachsenen isoliert Kardiomyozyten. Hier sind Verfahren zur Isolierung und Kultur, die Manipulation der Genexpression durch adenoviral expre präsentieren wirssed Proteine, und anschließende funktionelle Analyse von Kardiomyozyten aus der adulten Maus. Die Verwendung dieser Techniken wird dazu beitragen, mechanistischen Einblick in die zellulären Signalwege, die Erregbarkeit zu regulieren, Ca 2 + Dynamik und Kontraktilität zu entwickeln und eine viel physiologisch relevante Charakterisierung von Herz-Kreislauf-Krankheit.
Introduction
Murine Modelle von Herz-Kreislauf-Krankheit wurden als effektive Werkzeuge für die Aufklärung grundlegender Krankheitsmechanismen 1,2 als auch für potenzielle therapeutische Ziele 1,3 serviert. Insbesondere haben die Verwendung von sowohl murinen Modellen von erworbenen Herzerkrankungen (wie beispielsweise Druck-Überlast) von 4,5 und einer transgenen Mausmodellen unser Verständnis von Herzerkrankungen 6-8 vorgerückt. Die Verwendung von Zellkulturtechniken, um Signalkaskaden 3,9,10 und Änderungen in einzelne Proteine, die zelluläre Erregbarkeit und Erregung und Kontraktion unterliegen Kupplung im Herzen 11-13 auf der Ebene der Einzelzelle zu studieren, die in-vivo-Maus-Modelle ergänzt. Doch der Mangel an geeigneten Zelllinien, die Erwachsenen CM Struktur und Funktion reflektieren es eine deutliche Einschränkung. Forscher haben versucht, dies durch die Untersuchung einzelner Proteine, wie Ionenkanäle zu überwinden, die in heterologen Expressionssystemen <sup> 14, und während diese Studien haben uns mit nützlichen Informationen in Form von Ionenkanal-Protein Biophysik oder Menschenhandel, unzureichende Darstellung des nativen Mikroumgebung des CMs vorgesehen ist eine erhebliche Einschränkung. Zweitens, da die meisten dieser heterologen Zellen nicht über eine ausgereifte kontraktilen Apparates, es war nicht möglich, die kontraktile Funktion und das komplexe Zusammenspiel zwischen zellulären Erregbarkeit und Kontraktion zu studieren. Aus diesem Grund haben Forscher primären Herzzellkulturen für viele ihrer in vitro funktionelle Studien gemacht. Schließlich isolierte Kardiomyozyten Studien ermöglichen Beurteilung der Kontraktionsfunktion ohne die Störfaktoren von mehrzelligen Vorbereitung einschließlich der Auswirkungen von Narben oder Fibrose und der Faserorientierung.
Primäre neonatalen Ratten-Kardiomyozyten (NRVMs) sind relativ leicht zu Kultur, kann mit Adenoviren und Lentiviren infiziert, die Genexpression 15 zu manipulieren, einend haben deshalb ein erfolgreich verwendet worden, aber haben Einschränkungen ihrer eigenen. Obwohl sie einen physiologischen Mikroumgebung ein und wurden das Arbeitspferd der Signalisierungsfeld, wesentliche Unterschiede zwischen der Morphologie und subzellulärer Organisation NRVMs und Erwachsenen cardiomyoctyes machen sie eine unzureichende Modell für die Untersuchung der Ionenflüsse und-Elektromechanische Kopplung im erwachsenen Herzen . Vor allem fehlt eine definitive NRVMs t-Rohrsystem 4. Da Ca 2 +-Fluss und Dynamik sind entscheidend von reifen T-und Rohr Retikulum (SR) Struktur 6, Ca 2 + Dynamik und funktionelle Untersuchungen des kardialen Kontraktilität in NRVMs sind nicht eine genaue Reflexion dieser kritischen Prozesse in der Erwachsenenherzmuskelzellen. Weitere, einige Komponenten des Signalwege unterscheiden zwischen Neugeborenen und Erwachsenen Mäusen 9, wodurch ein weiterer Einschränkung für das Studium Krankheitsprozesse und deren impact auf die zelluläre Erregbarkeit und Kontraktilität in NRVMs. Schließlich ist die Verteilung des Kontraktionsmaschinen zu multidirektionale und ungleichmäßige Zellverkürzung Begrenzung der Genauigkeit der Kontraktionsmessungen.
Die Verwendung von isolierten adulten Kardiomyozyten stellt daher eine genauere in vitro Modellsystems. Das außergewöhnliche Wachstum von Wissen ermöglicht durch die genetische Manipulation von Mäusen möglich, unterstreicht die Bedeutung der Erlangung Funktions isolierten Herzmuskelzellen von Mäusen. In der Tat hat die Charakterisierung der Erwachsenen CMs von Mausmodellen isoliert Licht auf vielen biologischen und pathologischen Ereignisse zu vergießen. Isoliert CMs aus transgenen Mausmodelle für die Untersuchung der Gewinn oder Verlust der Funktion von Proteinen auf die kontraktilen Eigenschaften von Einzelzellen 2,16, und die Lebensfähigkeit in Krankheitsmodellen wie Ischämie / Reperfusion 17,18 erlaubt, damit Informationen aus de Ergänzung gewonnen vivo-Studien über diese Mäusen. Verwendung von isolierten adulten CMs von Mausmodellen von erworbenen Herzerkrankungen 3,19,20 (wie Quer Aortakonstriktion bedingten Drucklast, dass Bluthochdruck oder imitiert Aortenklappenstenose) oder Übung 5,21 (für die Modellierung von physiologischen Hypertrophie) ermöglicht die Prüfung der Wechselwirkung von Signalkaskaden bei diesen Verfahren mit zellulären Erregbarkeit und Erregung und Kontraktion Kupplung auf der Ebene der Einzelzelle gebracht. Darüber hinaus gibt uns die Fähigkeit, die Genexpression zu manipulieren mit Adenovirus-driven Genexpression in erwachsenen CMs die Möglichkeit, die Komponenten der komplexen Signalwege zu sezieren.
Aus einem elektro Sicht haben Ganzzellspannung und Stromklemme-Experimente an isolierten adulten CMs in der Aufklärung der Natur der Ionenflüsse zu Beginn und bei verschiedenen Krankheitszuständen kritisch. Aufgrund der komplexen Struktur der Zellmembran und dem Differential Protein Gerüststrukturen zwischen Erwachsenen und CMs NRVMs oder heterologen Zelllinien, die von adulten Zellen Fläche bietet eine viel bessere Darstellung der Wirkungen bestimmter Membranproteinen, Strukturproteine und Ionenkanalinteraktionspartner auf die elektrophysiologischen Komponenten des erwachsenen Herzen.
Trotz dieser prominenten Vorteile bei der Untersuchung adulten Kardiomyozyten, Isolierung und Kultivierung erwachsenen Mäusen Kardiomyozyten wurde eine Herausforderung, drängt die Notwendigkeit einer systematischen und genaue Beschreibung der Methodik, um lebensfähige Kardiomyozyten der Maus zu isolieren und in Kultur zu halten, um weitere genetische Manipulation ermöglicht mit viralen Vektoren. Frühere Studien haben entweder akut isolierten Maus Erwachsenen CMs oder Zucht erwachsenen Ratte CMs verwendet. Letztere sind leichter zu Kultur als erwachsene Maus CMs, und die meisten Experimente Manipulation der Genexpression in vitro erwachsenen Ratte CMs verwendet. Nur wenige Studien haben erfolgreich verändert und untersucht Funktional Genexpression in Maus Erwachsenen CMs, stellt eine große Einschränkung in den Rahmen von Experimenten. Daher hier im Detail präsentieren wir solche Methoden aus früheren Untersuchungen geändert, für die Isolierung 7,8,22, Kultur 3,10,15,23, Adenovirusinfektion 11-13,15 und funktionelle Analyse von erwachsenen Maus ventrikuläre cardiomyoctyes. Diese Isolation Protokoll Ergebnisse in Ca 2 +-tolerant, erregbare Herzmuskelzellen, die wir haben, bis zu 72 Stunden erfolgreich kultiviert und transient mit Adenovirus transfiziert. Die Funktionalität dieser isolierten Zellen unter Verwendung des Abbildungssystems MMSYS 14,24 und Patch-Clamp, die auch diskutiert werden bewertet.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Bericht haben wir die notwendigen Techniken für eine erfolgreiche Isolierung und Kultivierung von adulten CMs von der Maus Herz beschrieben. Unsere Technik kann für die anschließende Untersuchung der Funktion und CM Erregbarkeit unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren. Der kritische Parameter für das Studium der Erwachsenen CMs Funktionalität ist die Gesundheit und Qualität der isolierten CMs. Wie oben beschrieben, ermöglichen eine hohe Ausbeute an funktionellen Zellen zugänglich Manipulation…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282 | |
| D-glucose minimum | Sigma | G8270 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma | B0752 | |
| Collagenase B | Roche Applied Science | 11088807001 | |
| Collagenase D | Roche Applied Science | 11088858001 | |
| Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma | A2153 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C8106 | |
| Minimum Essential Media | Sigma | 51411C | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | |
| L-glutamine | Sigma | G3126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I1884 | |
| Cesium Chloride | Sigma | 289329 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Cesium Hydroxide Solution | Sigma | 232041 | |
| Tetraethylammonium hydroxide solution | Sigma | 86643 | |
| OptiVisor optical glass binocular visor | Dohegan Optical Company Inc. | N/A | |
| Tissue forceps, 5.5″, 1×2 teeth | Roboz Scientific | RS-8164 | |
| Moloney forceps – 4.5″ (11.5 cm) long slight curve, serrated | Roboz Scientific | RS-8254 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm | Roboz Scientific | RS-4966 | |
| Packer Mosquito Forceps 5″ Straight Flat | Roboz Scientific | RS-7114 | |
| Micro Dissecting Scissors 4.5″ Curved Sharp/Sharp | Roboz Scientific | RS-5917 | |
| Micro Dissecting Scissors 3.5″ Straight Sharp/Sharp20mm | Roboz Scientific | RS-5907 |
References
- Chlopcikova, S., Psotová, J. Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart. Biomedical Papers. , (2001).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat. Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
- Ballou, L. M., Lin, R. Z. Rapamycin and mTOR kinase inhibitors. J. Chem. Biol. 1, 27-36 (2008).
- Brette, F., Orchard, C. T-Tubule Function in Mammalian Cardiac Myocytes. Circ Res. , (2003).
- Sakata, Y., Hoit, B., Liggett, S., Walsh, R. Decompensation of pressure-overload hypertrophy in G?q-overexpressing mice. Circulation. , (1998).
- Lieu, D. K., et al. Absence of Transverse Tubules Contributes to Non-Uniform Ca 2+Wavefronts in Mouse and Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells and Development. 18, 1493-1500 (2009).
- Lim, H., De Windt, L., Mante, J., Kimball, T. Reversal of cardiac hypertrophy in transgenic disease models by calcineurin inhibition. J. Mol. Cell Cardiol. 32 (4), 697-709 (2000).
- Muthuchamy, M., et al. Mouse model of a familial hypertrophic cardiomyopathy mutation in alpha-tropomyosin manifests cardiac dysfunction. Circ. Res. 85, 47-56 (1999).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. J. Mol. Cell. Cardiol. 34, 807-821 (2002).
- Epstein, F., Hunter, J. Signaling pathways for cardiac hypertrophy and failure. New England Journal of Medicine. 341 (17), 1276-1283 (1999).
- Snopko, R., Aromolaran, A., Karko, K. Cell culture modifies Ca 2+ signaling during excitation-contraction coupling in neonate cardiac myocytes. Cell Calcium. , (2007).
- Ranu, H., Terracciano, C., Davia, K. Effects of Na+/Ca2+-exchanger overexpression on excitation-contraction coupling in adult rabbit ventricular myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 34 (4), 389-400 (2002).
- Kaab, S., Nuss, H. B., Chiamvimonvat, N., O’Rourke, B., Pak, P. H., Kass, D. A., Marban, E., Tomaselli, G. F. Ionic mechanism of action potential prolongation in ventricular myocytes from dogs with pacing-induced heart failure. Circ. Res. 78 (2), (1996).
- Splawski, I., et al. Variant of SCN5A sodium channel implicated in risk of cardiac arrhythmia. Science. 297, 1333-1336 (2002).
- Zhou, Y., Wang, S., Zhu, W. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279 (1), 429-436 (2000).
- Sussman, M., Lim, H., Gude, N., Taigen, T. Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition. Science. , (1998).
- Heinzel, F. R., et al. Impairment of diazoxide-induced formation of reactive oxygen species and loss of cardioprotection in connexin 43 deficient mice. Circ. Res. 97, 583-586 (2005).
- Li, X., Heinzel, F. R., Boengler, K., Schulz, R., Heusch, G. Role of connexin 43 in ischemic preconditioning does not involve intercellular communication through gap junctions. J. Mol. Cell. Cardiol. 36, 161-163 (2004).
- Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J., Chein, K. R. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).
- Nakamura, A., Rokosh, D. LV systolic performance improves with development of hypertrophy after transverse aortic constriction in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281 (3), 1104-1112 (2001).
- Boström, P., et al. A PGC1-?-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis. Nature. 481, 463-468 (2012).
- Liao, R., Jain, M. Isolation, culture, and functional analysis of adult mouse cardiomyocytes. Methods Mol. Med. 139, 251-262 (2007).
- Volz, A., Piper, H. M., Siegmund, B., Schwartz, P. Longevity of adult ventricular rat heart muscle cells in serum-free primary culture. J. Mol. Cell. Cardiol. 23, 161-173 (1991).
- Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. -. S. . Methods in Molecular Biology. 689, 205-214 (2010).
- Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. (47), e2269 (2011).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (20), e936 (2008).
- Arman, A. C., Sampath, A. P. Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation. J. Vis. Exp. (43), e2107 (2010).
- Wen, H., Brehm, P. Paired patch clamp recordings from motor-neuron and target skeletal muscle in zebrafish. J. Vis. Exp. (45), e2351 (2010).
- Maier, S., Westenbroek, R. An unexpected role for brain-type sodium channels in coupling of cell surface depolarization to contraction in the heart. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (6), 4073-4078 (2002).
- Shroff, S. G., Saner, D. R., Lal, R. Dynamic micromechanical properties of cultured rat atrial myocytes measured by atomic force microscopy. Am. J. Physiol. 269, 286-292 (1995).
- Domke, J., Parak, W. J., George, M., Gaub, H. E., Radmacher, M. Mapping the mechanical pulse of single cardiomyocytes with the atomic force microscope. European Biophysics Journal. 28, 179-186 (1999).
- Smith, B. A., Tolloczko, B., Martin, J. G., Grütter, P. Probing the Viscoelastic Behavior of Cultured Airway Smooth Muscle Cells with Atomic Force Microscopy: Stiffening Induced by Contractile Agonist. Biophysical Journal. 88, 2994-3007 (2005).
