Burada bir perfüzyon Langendorff sistemi kullanılarak erişkin fare cardiomyoctyes izolasyonunu tarif eder. Elde edilen hücreler, + toleranslı elektriksel olarak hareketsiz Ca2 ve kültürlenmiş ve adeno-veya gen ekspresyonunu değiştirmek için lentivirüsler ile transfekte edilmiş olabilir. Bunların işlevi de MMSYS sistemi ve yama kelepçe teknikler kullanılarak analiz edilebilir.
Kültür birincil kardiyomiyositlerindeki (CMS) kullanımı, kalp hastalığı anlayışımızı ilerleyen kalp hastalığı olan kemirgen modellerinde güçlü bir tamamlayıcı sağladı. Özellikle, hasta koşulları ve hastalığa neden olan mutasyonlar ile iyon homeostazı, iyon kanalı fonksiyonu, hücre uyarılabilirliğini ve uyanlma-kasılma kuplajı ve değişiklikler çalışma yeteneği kalp hastalıkları hakkında önemli bilgiler sağlamıştır. Ayrıca, kültür yetişkin CMS taklit etmek yeterli ölümsüzleştirdi hücre hattı eksikliği ve yenidoğan CMS sınırlamaları (erişkin CMS yapısal ve işlevsel biyomekanik özelliği nedeniyle birçok eksikliği olan), sinyal yolları arasındaki karmaşık etkileşimin anlayışımızı engel var iyon kanalları ve erişkin izole kardiyomiyositlerin okuyan önemini güçlendirilmesi erişkin kalp kasılma özellikleri. Burada, adenoviral-Expre ile gen ekspresyonunun izolasyon, kültür, manipülasyon için yöntemler sunmakssed proteinleri ve erişkin fare kardiyomiyositlerin sonraki fonksiyonel analiz. Bu tekniklerin kullanımı hücresel eksitabilitesi düzenleyen yolları, Ca 2 + dinamiklerini ve kasılma sinyalizasyon içine mekanik anlayış geliştirmek ve kardiyovasküler hastalık çok daha önemli fizyolojik karakterizasyonu sağlamak için yardımcı olacaktır.
Kalp-damar hastalığı olan kemirgen modellerinde potansiyel terapötik hedefler 1,3 belirlenmesi için temel bir hastalık mekanizmalarının 1,2 açıklık yanı sıra için etkili araçlar olarak hizmet etmişlerdir. Özellikle, (örneğin basınç aşırı olarak) edinilmiş kalp hastalıklarının hem kemirgen modellerinde 4,5 ve transgenik fare modellerinin kullanımının kalp hastalığı 6-8 anlayışımızı gelişmiş var. Tek hücre düzeyinde kalp 11-13 hücre uyarılabilirliğini ve uyanlma-kasılma kaplin altında yatan tek tek proteinler de sinyal iletim 3,9,10 ve değişiklikler çalışma hücre kültürü tekniklerinin kullanımı in vivo fare modelleri tamamlayıcı var. Bununla birlikte, yetişkin CM yapısı ve fonksiyonu yansıtır yeterli hücre çizgilerinin olmaması önemli bir sınırlama olmuştur. Araştırmacılar, heterolog sentezleme sistemlerinde, örneğin iyon kanalları gibi tek tek proteinler, inceleyerek bu üstesinden gelmek çalışmışlardır <sup> 14, ve bu çalışmalar iyon kanal biyofizik veya protein kaçakçılığı, CMS yerli mikro yetersiz temsili açısından yararlı bilgiler bize vermiş ise önemli bir kısıtlamadır. İkinci olarak, bu heterolog hücrelerin çoğu olgun bir kasılma aparatı yok çünkü, bu kasılma fonksiyonunu ve hücresel uyarılmayı ve daralma arasındaki karmaşık etkileşimi incelemek mümkün olmamıştır. Bu nedenle araştırmacılar, in vitro fonksiyonel çalışmaların çoğu için temel kardiyak hücre kültürlerine döndü. Son olarak, izole kardiyomyosit çalışmalar skar veya fibrozis ve fiber yönlendirme etkisi dahil çok hücreli hazırlık faktörlerin olmayan kasılma fonksiyonu değerlendirmesini sağlar.
İlköğretim yenidoğan sıçan ventrikül kardiyomiyositler (NRVMs) kültür nispeten kolay, gen ifadesini 15 işlemek için adenovirüslerden ve lentivirüsler ile enfekte olabilir olduğu birnd nedenle başarıyla 1 kullanılır, ancak kendi sınırlamaları var olmuştur. Bir fizyolojik mikroortam 1 sağlamak ve sinyal alanın beygir olmasına rağmen, morfoloji ve NRVMs ve yetişkin cardiomyoctyes subselüler örgüt arasındaki önemli farklar onları erişkin kalp iyonik eritici ve uyarılma-kasılma kenet soruşturma için yetersiz bir model yapmak . En önemlisi NRVMs kesin bir t-tüp şeklindeki alt sistem 4 yoksundur. Ca 2 + akı ve dinamikleri olgun t-boru ve sarkoplazmik retikulum (SR) yapısı 6, Ca 2 + dinamikleri ve NRVMs yılında kalp kasılmasında fonksiyonel çalışmalarda kritik bağımlı olduğundan erişkin kardiomyositlerindeki bu kritik süreçlerin doğru bir yansıması değildir. Ayrıca, sinyal yollarının bazı bileşenler, böylece başka bir hastalık süreçlerini incelemek için sınırlama ve i sağlayarak, yenidoğan ve yetişkin farelerin 9 arasında farklılıkNRVMs hücresel uyarılmayı ve kasılma Mpact. Son olarak, kasılma makine dağıtım kontraktil ölçümlerin doğruluğunu sınırlayan çok yönlü ve düzgün olmayan hücre kısalmasına yol açar.
Izole edilmiş yetişkin kardiyomiyositlerde kullanılması bu nedenle, daha doğru bir in vitro model sistemi sağlar. Farelerin genetik manipülasyonu ile mümkün bilginin olağanüstü büyüme farelerden izole edilmiş fonksiyonel kardiyomiyositlerde elde önemini vurgulamaktadır. Aslında, fare modellerinde izole yetişkin CMS karakterizasyonu birçok biyolojik ve patolojik olaylara ışık tutmuştur. Transgenik fare modellerinde izole CMs ve böylece de elde edilen bilgiler tamamlayıcı, iskemi / reperfüzyon 17,18 gibi hastalık modellerinde kazanç ya da proteinlerin fonksiyon kaybı tek hücre 2,16 kasılma özelliklerini ve canlılığı çalışmaları için izin in vivo çalışmalardase fareler. Ya da (fizyolojik hipertrofisi modelleme için) egzersiz 5,21 incelenmesi için izin verir (mimikler hipertansiyon veya aort kapak darlığı böyle enine aort daralma kaynaklı basınç yüklenmesi gibi) edinilmiş kalp hastalığı 3,19,20 sıçan modellerinde izole erişkin CMS Kullanımı tek hücre düzeyinde hücresel uyarılımın ve uyanlma-kasılma kaplin ile bu işlemlerde rol sinyal iletim etkileşimi. Ayrıca, yetişkin CMS adenoviral odaklı gen ifadesi kullanılarak gen ifadesini işlemek için yeteneği bize karmaşık sinyal yollarının bileşenlerini incelemek için fırsat tanıyor.
Elektrofizyolojik bir perspektiften bakıldığında, tüm hücre voltaj ve izole yetişkin CMS güncel kelepçe deneyler Başlangıçta iyonik akılarının doğasını durulaştırmada ve çeşitli hastalık durumlarında kritik olmuştur. Nedeniyle hücre zarının karmaşık yapısı ve diferansiyel proteYetişkin Cms ve NRVMs ya da heterolog hücre hatları arasında iskele yapılarda, yetişkin hücrelerin yama yeteneği belirli zar proteinleri, yapısal proteinler, ve yetişkin kalp elektrofizyolojik parçaları üzerinde iyon kanalı etkileşim ortaklarının etkileri çok daha iyi bir temsilini verir.
, Yetişkin kemirgen kardiyomiyositlerin okuyan tecrit ve yetişkin fareler kardiyomiyositler zorlu olmuştur kültüre, canlı fare kardiyomiyositlerin izole etmek ve viral kullanarak daha fazla genetik manipülasyon izin kültür onları korumak için metodoloji sistematik ve doğru açıklama için ihtiyaç çağıran böyle önemli avantajlara rağmen vektörleri. Önceki çalışmalar akut izole fare yetişkin CMS veya kültür sıçan yetişkin CMS ya kullandık. İkincisi yetişkin fare cm daha kültüre kolaydır ve in vitro olarak gen ifadesini manipüle en deneyleri sıçan yetişkin cm kullandık. Birkaç çalışmaları başarıyla değişmiş ve functi araştırdıkdeneyler kapsamında büyük bir sınırlama sunulması yetişkin fare CMS onal gen ifadesi. Bu nedenle, burada detaylı olarak izolasyon 7,8,22, kültür 3,10,15,23, adenoviral enfeksiyon 11-13,15 ve yetişkin fare ventriküler cardiomyoctyes fonksiyonel analizi için önceki soruşturmalarda modifiye gibi metodolojileri, mevcut. Bu izolasyon protokolünün kadar 72 saat boyunca başarılı bir şekilde kültürlendi ve geçici olarak adenovirüs ile transfekte sahip Ca2 +-dayanıklı, uyarılabilen kardiyomiyositlerde sonuçlanır. Bu izole edilmiş hücrelere ait işlevleri MMSYS 14,24 ve görüntüleme sistemi ayrıca tartışılacaktır yama kelepçe kullanılarak değerlendirilebilir.
Bu yazıda, fare kalp başarılı izolasyonu ve yetişkin CMS kültürü için gerekli teknikleri tarif var. Bizim teknik, yukarıda tarif edilen metotlar kullanılarak CM fonksiyon uyarılma ve daha sonra çalışma için izin verir. Yetişkin CMS işlevselliğini eğitim için kritik parametre izole CMS sağlık ve kalitesidir. Yukarıda tarif edildiği gibi, teknik adenoviral / lentiviral kültüründe enfeksiyonları ve hücresel uyarılımın ve kontraktil fonksiyon analizi kullanılarak gen ekspresyonunun manipül…
The authors have nothing to disclose.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282 | |
D-glucose minimum | Sigma | G8270 | |
Taurine | Sigma | T0625 | |
2,3-Butanedione monoxime | Sigma | B0752 | |
Collagenase B | Roche Applied Science | 11088807001 | |
Collagenase D | Roche Applied Science | 11088858001 | |
Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | |
Albumin from Bovine Serum | Sigma | A2153 | |
Calcium Chloride | Sigma | C8106 | |
Minimum Essential Media | Sigma | 51411C | |
Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | |
L-glutamine | Sigma | G3126 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I1884 | |
Cesium Chloride | Sigma | 289329 | |
Glutamate | Sigma | G3291 | |
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
Cesium Hydroxide Solution | Sigma | 232041 | |
Tetraethylammonium hydroxide solution | Sigma | 86643 | |
OptiVisor optical glass binocular visor | Dohegan Optical Company Inc. | N/A | |
Tissue forceps, 5.5″, 1×2 teeth | Roboz Scientific | RS-8164 | |
Moloney forceps – 4.5″ (11.5 cm) long slight curve, serrated | Roboz Scientific | RS-8254 | |
Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm | Roboz Scientific | RS-4966 | |
Packer Mosquito Forceps 5″ Straight Flat | Roboz Scientific | RS-7114 | |
Micro Dissecting Scissors 4.5″ Curved Sharp/Sharp | Roboz Scientific | RS-5917 | |
Micro Dissecting Scissors 3.5″ Straight Sharp/Sharp20mm | Roboz Scientific | RS-5907 |