Isolamento, Cultura e caratterizzazione funzionale di topo adulto Cardiomyoctyes
Summary
Qui si descrive l'isolamento di cardiomyoctyes adulte di topo mediante un sistema di perfusione Langendorff. Le cellule risultanti sono Ca2 +-tolerant, elettricamente quiescente e può essere colta e trasfettate con-adeno o lentivirus per manipolare l'espressione genica. La loro funzionalità può anche essere analizzato con il sistema MMSYS e tecniche di patch clamp.
Abstract
L'uso di cardiomiociti primari (CMS) in cultura ha fornito un potente complemento modelli murini di malattie cardiache nelle avanzare la nostra comprensione di malattie cardiache. In particolare, la capacità di studiare l'omeostasi di ioni, la funzione del canale ionico, eccitabilità cellulare e accoppiamento eccitazione-contrazione e loro alterazioni in condizioni malate e da mutazioni patogenetiche hanno portato a intuizioni significative sulle malattie cardiache. Inoltre, la mancanza di una linea cellulare adeguata immortalato per imitare adulti CM, e le limitazioni della neonatale CM (che mancano molti dei biomeccanica caratteristica strutturale e funzionale degli adulti CMS) in coltura hanno ostacolato la nostra comprensione della complessa interazione tra le vie di segnalazione, canali ionici e le proprietà contrattili del cuore adulto rafforzare l'importanza di studiare adulte isolate cardiomiociti. Qui vi presentiamo i metodi per l'isolamento, la cultura, la manipolazione dell'espressione genica da adenovirus-espresproteine ssed, e la successiva analisi funzionale dei cardiomiociti dal topo adulto. L'uso di queste tecniche vi aiuterà a sviluppare la comprensione meccanicistica in vie di segnalazione che regolano l'eccitabilità cellulare, Ca 2 + dinamiche e contrattilità e di fornire una caratterizzazione molto più fisiologicamente rilevanti di malattie cardiovascolari.
Introduction
Modelli murini di malattie cardiovascolari sono serviti come strumenti efficaci per chiarire i meccanismi fondamentali di malattia 1,2 e per identificare potenziali obiettivi terapeutici 1,3. In particolare, l'utilizzo di entrambi i modelli murini di malattia cardiaca acquisita (per esempio pressione sovraccarico) 4,5 e modelli di topi transgenici hanno avanzato la nostra comprensione di malattie cardiache 6-8. L'uso di tecniche di coltura cellulare per studiare cascate di segnalazione 3,9,10 e alterazioni in singole proteine che sono alla base eccitabilità cellulare e accoppiamento eccitazione-contrazione nel cuore 11-13 a livello di singola cellula hanno integrato i modelli di topo in vivo. Tuttavia, la mancanza di linee cellulari adeguate che riflettono la struttura e la funzione adulto CM è una limitazione significativa. Gli investigatori hanno cercato di superare questo studiando singole proteine, come i canali ionici, in sistemi di espressione eterologhi <sup> 14, e mentre questi studi ci hanno fornito informazioni utili in termini di biofisica dei canali ionici o traffico di proteine, la rappresentazione inadeguata del microambiente nativo di CMS è una limitazione significativa. In secondo luogo, poiché la maggior parte di queste cellule eterologhe non hanno un apparato contrattile maturo, ma non e stato possibile studiare la funzione contrattile e la complessa interazione tra l'eccitabilità e la contrazione cellulare. Per questo motivo, i ricercatori si sono rivolti a colture cellulari primarie cardiaco per molti dei loro studi funzionali in vitro. Infine, gli studi cardiomiociti isolati consentono la valutazione della funzione contrattile senza i fattori di confondimento di preparazione multicellulare compreso l'effetto di cicatrice o fibrosi e orientamento delle fibre.
Primarie neonatali cardiomiociti di ratto ventricolari (NRVMs) sono relativamente facili da cultura, possono essere infettati con adenovirus e lentivirus per manipolare l'espressione genica 15, unnd sono stati quindi utilizzati con successo 1, ma hanno dei limiti dei loro propri. Anche se offrono un microambiente fisiologico 1 e sono stati il cavallo di battaglia del campo di segnalazione, le differenze sostanziali tra la morfologia e l'organizzazione subcellulare di NRVMs e cardiomyoctyes adulti li rendono un modello inadeguato per lo studio dei flussi ionici e accoppiamento eccitazione-contrazione nel cuore adulto . In particolare NRVMs mancano di una t-tubolare sottosistema definitivo 4. Da Ca 2 + flusso e la dinamica sono criticamente dipendente matura t-tubulare e reticolo sarcoplasmatico (SR) Struttura 6, Ca 2 + dinamiche e gli studi funzionali della contrattilità cardiaca in NRVMs non sono una riflessione accurata di questi processi critici in cardiomiociti adulti. Inoltre, alcuni componenti di vie di segnalazione differiscono tra neonatale ed adulta topi 9, fornendo così un altro limite per lo studio dei processi di malattia e la loro iIMPATTO su eccitabilità cellulare e contrattilità in NRVMs. Infine, la distribuzione della macchina contrattile provoca l'accorciamento cella multidirezionali e non uniforme limitando la precisione delle misure contrattili.
L'uso di cardiomiociti isolati adulte fornisce quindi un più accurato sistema di modellazione in vitro. La straordinaria crescita della conoscenza resa possibile dalla manipolazione genetica di topi sottolinea l'importanza di ottenere cardiomiociti funzionali isolate da topi. Infatti, la caratterizzazione di CM adulte isolate da modelli murini ha fatto luce su molti eventi biologici e patologici. Isolato CMS da modelli di topi transgenici hanno permesso per studi del guadagno o la perdita della funzione delle proteine sulle proprietà contrattili delle singole cellule 2,16, e la vitalità in modelli di malattia come ischemia / riperfusione 17,18, integrando in tal modo le informazioni acquisite de Studi in vivo sultopi sé. L'uso di isolati adulto CMS da modelli murini di malattie cardiache acquisite 3,19,20 (come il sovraccarico trasversale aortica costrizione indotta pressione, che imita l'ipertensione o stenosi valvolare aortica) o l'esercizio 5,21 (per la modellazione di ipertrofia fisiologica) consente per l'esame dell'interazione di cascate di segnalazione implicati in questi processi con l'eccitabilità cellulare e accoppiamento eccitazione-contrazione a livello di singola cellula. Inoltre, la capacità di manipolare l'espressione genica usando l'espressione dei geni, guidato in adulto CMs ci offre l'opportunità di sezionare i componenti di vie di segnalazione complessi.
Dal punto di vista elettrofisiologico, tensione whole-cell e gli esperimenti clamp attuali isolato adulto CM sono stati critici nel chiarire la natura dei flussi ionici al basale e in vari stati di malattia. A causa della complessa struttura della membrana cellulare e la prote differenzialein strutture ponteggi tra adulti CM e NRVMs o linee cellulari eterologhi, la possibilità di patchare le cellule adulte fornisce una migliore rappresentazione degli effetti di alcune proteine di membrana, proteine strutturali, e che interagiscono partner di canale di ioni sui componenti elettrofisiologiche del cuore adulto.
Nonostante tali vantaggi importanti nello studio degli adulti cardiomiociti murini, isolamento e coltura di cardiomiociti topi adulti è stato impegnativo, sollecitando la necessità di una descrizione sistematica e accurata della metodologia per isolare cardiomiociti vitali mouse e al loro mantenimento in coltura per consentire un ulteriore manipolazione genetica utilizzando virale vettori. Precedenti studi hanno utilizzato sia acuto isolato topo adulto CMS o coltivate ratto adulto CM. Questi ultimi sono più facili da cultura di topo adulto CM, e la maggior parte degli esperimenti di manipolazione di espressione genica in vitro hanno usato ratto adulto CM. Pochi studi hanno modificato con successo e indagato functiespressione genica onale in topo adulto CM, presentando una grande limitazione nella portata di esperimenti. Pertanto, qui vi presentiamo in dettaglio tali metodologie, modificati dalle indagini precedenti, per l'isolamento 7,8,22, cultura 3,10,15,23, infezione adenovirale 11-13,15, e analisi funzionale di cardiomyoctyes ventricolari topo adulto. Questo protocollo isolamento risultati in Ca 2 +-tolleranti, cardiomiociti eccitabili che abbiamo successo in coltura per un massimo di 72 ore e transitoriamente trasfettate con adenovirus. La funzionalità di queste cellule isolate può essere valutata utilizzando il sistema di imaging MMSYS 14,24 e patch clamp, che sarà anche discusso.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo rapporto, abbiamo descritto le tecniche necessarie per l'isolamento di successo e la cultura degli adulti CM dal cuore mouse. La nostra tecnica consente successivo studio della funzione CM e l'eccitabilità con i metodi sopra descritti. Il parametro critico per studiare la funzionalità di adulto CMS è la salute e la qualità della isolato CM. Come descritto sopra, le nostre tecniche consentono un elevato rendimento di cellule funzionali che sono suscettibili di manipolazione dell'espressione geni…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282 | |
| D-glucose minimum | Sigma | G8270 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma | B0752 | |
| Collagenase B | Roche Applied Science | 11088807001 | |
| Collagenase D | Roche Applied Science | 11088858001 | |
| Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma | A2153 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C8106 | |
| Minimum Essential Media | Sigma | 51411C | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | |
| L-glutamine | Sigma | G3126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I1884 | |
| Cesium Chloride | Sigma | 289329 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Cesium Hydroxide Solution | Sigma | 232041 | |
| Tetraethylammonium hydroxide solution | Sigma | 86643 | |
| OptiVisor optical glass binocular visor | Dohegan Optical Company Inc. | N/A | |
| Tissue forceps, 5.5″, 1×2 teeth | Roboz Scientific | RS-8164 | |
| Moloney forceps – 4.5″ (11.5 cm) long slight curve, serrated | Roboz Scientific | RS-8254 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm | Roboz Scientific | RS-4966 | |
| Packer Mosquito Forceps 5″ Straight Flat | Roboz Scientific | RS-7114 | |
| Micro Dissecting Scissors 4.5″ Curved Sharp/Sharp | Roboz Scientific | RS-5917 | |
| Micro Dissecting Scissors 3.5″ Straight Sharp/Sharp20mm | Roboz Scientific | RS-5907 |
References
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