Isolement, culture et caractérisation fonctionnelle des adultes Cardiomyoctyes souris

Summary

Nous décrivons ici l'isolement de cardiomyoctyes de souris adultes en utilisant un système de perfusion de Langendorff. Les cellules résultantes sont des ions Ca2 + à tolérance de repos électriquement et peuvent être cultivées et transfectées avec l'adénovirus ou de lentivirus de manipuler l'expression génique. Leur fonctionnalité peut également être analysé en utilisant le système MMSYS et techniques de patch-clamp.

Abstract

L'utilisation des cardiomyocytes primaires (CMS) dans la culture a fourni un complément puissant pour des modèles murins de la maladie de coeur dans l'avancement de notre compréhension de la maladie de coeur. En particulier, la capacité à étudier l'homéostasie ionique, de la fonction de canal ionique, l'excitabilité cellulaire et le couplage excitation-contraction et leurs altérations dans des conditions pathologiques et par des mutations pathogènes ont conduit à des avancées importantes au niveau des maladies cardiaques. En outre, l'absence d'une ligne suffisante de cellules immortalisées à imiter les adultes GC, et les limites de néonatale CM (qui n'ont pas beaucoup de la caractéristique de la biomécanique structurale et fonctionnelle des adultes MC) dans la culture ont entravé notre compréhension de l'interaction complexe entre les voies de signalisation, les canaux ioniques et les propriétés contractiles du coeur adulte renforcer l'importance d'étudier adultes cardiomyocytes isolés. Ici, nous présentons des procédés pour l'isolement, la culture, la manipulation de l'expression de gène par adenovirus expreprotéines sseD et analyse fonctionnelle ultérieure de cardiomyocytes de la souris adulte. L'utilisation de ces techniques permettra de développer une approche mécanistique dans les voies de régulation de l'excitabilité cellulaire, Ca ^{2 +} dynamique et la contractilité de signalisation et de fournir une caractérisation beaucoup plus physiologiquement pertinents de maladies cardio-vasculaires.

Introduction

Des modèles murins de maladie cardio-vasculaire ont servi d'outils efficaces pour élucider les mécanismes de la maladie ^1,2 fondamentales, ainsi que pour l'identification de cibles thérapeutiques potentielles ^1,3. En particulier, l'utilisation des deux modèles murins de maladies cardiaques acquises (tels que la pression de surcharge) et ^4,5 modèles de souris transgéniques ont fait progresser notre compréhension de la maladie cardiaque ^6-8. L'utilisation de techniques de culture de cellules à étudier cascades de signalisation ^3,9,10 et modifications dans les protéines individuelles qui sous-tendent l'excitabilité cellulaire et le couplage excitation-contraction dans le coeur ^{de 11 à 13} au niveau de la cellule unique ont complété les modèles in vivo de souris. Cependant, le manque de lignées cellulaires appropriées qui reflètent la structure et la fonction des adultes CM a une limitation importante. Les investigateurs ont tenté de surmonter ce par l'étude de protéines individuelles, telles que des canaux ioniques, dans des systèmes d'expression hétérologues <sup> 14, et bien que ces études nous ont fourni des informations utiles en termes de biophysique de canaux ioniques ou le trafic de protéines, représentation inadéquate de la micro-natif de la CMS est une limitation importante. Deuxièmement, puisque la plupart de ces cellules hétérologues n'ont pas un appareil contractile mature, il n'a pas été possible d'étudier la fonction contractile et l'interaction complexe entre l'excitabilité cellulaire et la contraction. Pour cette raison, les chercheurs se sont tournés vers des cultures de cellules primaires cardiaque pour beaucoup de leurs études fonctionnelles in vitro. Enfin, des études de cardiomyocytes isolés permettent d'évaluer la fonction contractile sans les facteurs de confusion de préparation multicellulaire y compris l'effet de cicatrice ou de la fibrose et de l'orientation des fibres.

Néonatales cardiomyocytes ventriculaires de rat primaires (NRVMs) sont relativement facile à la culture, peuvent être infectées par des adénovirus et lentivirus de manipuler l'expression du gène ^15, une ont donc été utilisée avec succès ^une, mais des limites de leur propre. Bien qu'ils fournissent un microenvironnement physiologique ¹ et ont été le cheval de bataille du champ de signalisation, des différences substantielles entre la morphologie et l'organisation subcellulaire de NRVMs et cardiomyoctyes adultes en font un modèle pour l'étude des flux ioniques et couplage excitation-contraction dans le coeur adulte insuffisant . Plus particulièrement NRVMs définitif n'ont pas une sous-système tubulaire ^t-4. Depuis Ca ^{2 +} flux et dynamique dépendent de façon critique sur des T-tubulaire maturité et le réticulum sarcoplasmique (RS) la structure ^6, Ca ^{2 +} dynamique et des études fonctionnelles de la contractilité cardiaque dans NRVMs ne sont pas un reflet exact de ces processus critiques dans les cardiomyocytes adultes. De plus, certains composants de voies de signalisation diffèrent entre les souriceaux nouveau-nés et les adultes ^9, fournissant ainsi une autre limitation pour étudier les processus de la maladie et leur impact sur l'excitabilité cellulaire et la contractilité dans NRVMs. Enfin, la distribution de la machinerie contractile conduit à un raccourcissement de la cellule multidirectionnel et non uniforme limitant la précision des mesures contractiles.

L'utilisation des cardiomyocytes adultes isolés fournit donc un système de modélisation plus précise in vitro. La croissance extraordinaire des connaissances rendue possible par la manipulation génétique de la souris souligne l'importance d'obtenir des cardiomyocytes isolés fonctionnels de souris. En fait, la caractérisation des adultes CM isolés à partir des modèles de souris a mis en lumière de nombreux événements biologiques et pathologiques. CM isolés à partir de modèles de souris transgéniques ont permis d'études du gain ou de la perte de la fonction des protéines sur les propriétés contractiles des cellules simples ^2,16, et la viabilité des modèles de maladies telles que l'ischémie / reperfusion ^17,18, complétant ainsi les informations obtenues à partir de Des études in vivo sur l'souris soi. Utilisation d'adulte isolé CM de modèles murins de maladie cardiaque acquise ^3,19,20 (comme aortique surcharge transversale de pression induite par constriction, qui imite l'hypertension ou la sténose aortique) ou de l'exercice ^5,21 (pour la modélisation de l'hypertrophie physiologique) permet à l'examen de l'interaction des cascades de signalisation impliquées dans ces processus avec de l'excitabilité cellulaire et le couplage excitation-contraction au niveau de la cellule unique. En outre, la capacité de manipuler l'expression des gènes en utilisant l'expression du gène conduit adenovirus en adulte CM nous donne l'occasion de disséquer les composants de voies de signalisation complexes.

Du point de vue électrophysiologique, la tension de cellule entière et expériences actuelles de serrage sur adulte isolé CM ont été essentiels dans la compréhension de la nature des flux ioniques au départ et dans divers états pathologiques. En raison de la structure complexe de la membrane cellulaire et la prote différentieldans les structures d'échafaudage entre adultes GC et NRVMs ou des lignées de cellules hétérologues, la possibilité de patcher les cellules adultes donne une bien meilleure représentation des effets de certaines protéines membranaires, des protéines structurelles et canaux ioniques partenaires d'interaction sur les composantes électrophysiologiques du cœur adulte.

En dépit de ces avantages importants dans l'étude adultes cardiomyocytes murins, l'isolement et la culture de cardiomyocytes de souris adultes ont été difficiles, insistant sur la nécessité d'une description systématique et précise de la méthodologie pour isoler les cardiomyocytes de souris viables et à les maintenir en culture à la poursuite de la manipulation génétique en utilisant virale vecteurs. Des études antérieures ont utilisé soit des adultes de la souris aiguë isolé GC ou adulte de rat cultivés GC. Ces derniers sont plus facile à la culture de la souris adulte MC, et la plupart des expériences de manipulation expression génique in vitro ont utilisé rat adulte GC. Peu d'études ont modifié avec succès et une enquête fonctil'expression du gène onal des adultes de la souris CM, présentant une grande limitation dans le champ d'expériences. Par conséquent, nous présentons ici en détail ces méthodes, modifiés à partir des enquêtes précédentes, pour l'isolement ^7,8,22, culture ^3,10,15,23, infection adénoviral ^11-13,15, et l'analyse fonctionnelle de cardiomyoctyes ventriculaires de souris adultes. Ce protocole d'isolement des résultats dans Ca ^{2 +,} les cardiomyocytes excitables tolérantes que nous avons cultivées avec succès jusqu'à 72 h et transfectées de façon transitoire avec l'adénovirus. La fonctionnalité de ces cellules isolées peuvent être évaluées à l'aide du système d'imagerie et MMSYS ^14,24 patch clamp, qui sera également discuté.

Protocol

Une. Cardiomyocytes Isolation Matériaux (Figure 1) Microdissecting forceps Pince de tissus Pinces hémostatiques délicates Pinces hémostatiques Microdissecting, en dents de scie, pinces courbes Ciseaux d'exploitation, droit Ciseaux d'exploitation, courbe 15 ml des tubes Falcon (5) 60 mm boîte de Petri Phosphate Buffered Saline (PBS) Nylon Mesh – taille des pores 400 p…

Representative Results

L'isolement des résultats cardiomyoctyes adultes dans des cellules en forme de baguette, striées, et quiescentes (pas spontanément battant) (Figure 5A). Les cellules mortes seront look arrondi et aucun stries seront présents. Cellules au repos peuvent être cultivées et transfectées avec l'adénovirus de manipuler l'expression des gènes (figures 5B et 5C). Après 24 heures de culture, la morphologie des cellules vivantes ne change pas, ils sont encore…

Discussion

Dans ce rapport, nous avons décrit les techniques nécessaires pour permettre l'isolement et la culture des adultes CM du coeur de la souris. Notre technique permet une étude subséquente de la fonction et de l'excitabilité CM utilisant les procédés décrits ci-dessus. Le paramètre critique pour l'étude de la fonctionnalité des adultes MC est la santé et la qualité de l'isolement CM. Comme décrit ci-dessus, nos techniques permettent un rendement élevé de cellules fonctionnelles qui se prête…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma	S7653
Potassium Chloride	Sigma	P9333
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
HEPES	Sigma	H3375
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S8282
D-glucose minimum	Sigma	G8270
Taurine	Sigma	T0625
2,3-Butanedione monoxime	Sigma	B0752
Collagenase B	Roche Applied Science	11088807001
Collagenase D	Roche Applied Science	11088858001
Protease XIV from Streptomyces griseus	Sigma	P5147
Albumin from Bovine Serum	Sigma	A2153
Calcium Chloride	Sigma	C8106
Minimum Essential Media	Sigma	51411C
Albumin solution from bovine serum	Sigma	A8412
L-glutamine	Sigma	G3126
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement	Sigma	I1884
Cesium Chloride	Sigma	289329
Glutamate	Sigma	G3291
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid	Sigma	E3889
Cesium Hydroxide Solution	Sigma	232041
Tetraethylammonium hydroxide solution	Sigma	86643
OptiVisor optical glass binocular visor	Dohegan Optical Company Inc.	N/A
Tissue forceps, 5.5″, 1×2 teeth	Roboz Scientific	RS-8164
Moloney forceps – 4.5″ (11.5 cm) long slight curve, serrated	Roboz Scientific	RS-8254
Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm	Roboz Scientific	RS-4966
Packer Mosquito Forceps 5″ Straight Flat	Roboz Scientific	RS-7114
Micro Dissecting Scissors 4.5″ Curved Sharp/Sharp	Roboz Scientific	RS-5917
Micro Dissecting Scissors 3.5″ Straight Sharp/Sharp20mm	Roboz Scientific	RS-5907