Summary
Le fluide ventriculaire céphalo-rachidien (LCR) baigne les cellules neuro-épithéliales corticales et progénitrices cérébrale au cours du développement précoce du cerveau chez l'embryon. Nous décrivons ici la méthode mise au point pour isoler le LCR ventriculaire à partir d'embryons de rongeurs d'âges différents afin d'étudier sa fonction biologique. En outre, nous démontrons notre dissection cérébrale corticale explant et la technique de culture qui permet la croissance des explants avec des volumes minimaux de milieu de culture ou le LCR.
Abstract
Le LCR est un liquide complexe avec un protéome de faire varier dynamiquement au cours du développement et chez l'adulte. Au cours du développement embryonnaire, le CSF naissante différencie du liquide amniotique lors de la fermeture du tube neural antérieur. Le volume de LCR augmente alors que les jours qui suivirent les cellules souches neuro-épithéliales qui tapissent les ventricules et le plexus choroïde générer LCR. Les contacts embryonnaires LCR de la surface apicale ventriculaire, des cellules souches neurales du cerveau en développement et la moelle épinière. CSF fournit une pression de fluide essentiel pour le développement du cerveau en développement et distribue croissance importante de facteurs favorisant cellules progénitrices neurales d'une manière temporellement spécifique. Pour étudier la fonction de la LCR, il est important d'isoler des échantillons purs de CSF embryonnaire sans contamination par le sang ou le tissu développer télencéphalique. Nous décrivons ici une technique pour isoler des échantillons relativement purs du ventricule embryonnaire CSF qui peuvent être utilisés pourun grand nombre de tests de laboratoire dont la spectrométrie de masse, électrophorèse des protéines, et la culture de cellules et explant primaire. Nous démontrons comment disséquer et à la culture des explants de cortex sur des membranes de polycarbonate poreux pour grandir développer le tissu cortical avec des volumes réduits de médias ou le LCR. Avec cette méthode, les expériences peuvent être effectuées en utilisant le LCR de différents âges ou de conditions d'enquêter sur l'activité biologique du protéome CSF sur les cellules cibles.
Introduction
Le LCR est un liquide complexe qui baigne le développement neuro-épithélium 1-6 et fournit une pression de 7 essentiels et de promouvoir la croissance des indices pour le développement du cerveau 8-12. Pour étudier le CSF au cours du développement du cerveau, nous avons développé des techniques pour isoler le LCR ventriculaire du développement des embryons de rat ou de la souris pendant divers stades de développement 6,9. Les méthodes précédentes de l'isolement à l'aide d'un verre inclus micro-aiguille et l'isolement de la peste porcine classique en utilisant un micro-injecteur 1,2. Notre méthode utilise un verre micro-pipette capillaire dont la pointe a été retiré pour créer un point ultrafin pour la pénétration tissulaire améliorée. Le verre micro-pipette capillaire est relié à un aspirateur de sorte que la collecte CSF ventriculaire peut être commandé avec des modifications de la pression douce. Pour étudier l'influence de cellules souches de signaux CSF, nous disséquer cérébrales corticales explants, les placer sur des membranes de polycarbonate, et les faire flotter sur la cu appropriéesmoyen lture complétée par des échantillons de LCR 9. Avec cette technique, la baisse des volumes de médias sont suffisants pour la culture des tissus, ce qui permet une utilisation efficace des CSF 9.
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Protocol
1. Isolation embryon / Préparation
Cette technique peut être utilisée pour la souris ou le rat. Dans ce protocole, nous allons démontrer la technique de collecte de CSF et cérébrale corticale dissection explant avec la souris embryonnaire du cerveau. Nous allons commenter les différences importantes par rapport aux souris pour les rats qui existent dans les techniques générales. Pour le système de classification d'âge embryonnaire, E1 est classé comme le jour de la fiche pour les rats, et E0.5 est classé comme le jour de la fiche pour les souris.
- Préparer un plat micro-dissection avec du Sylgard silicone élastomère. Elastomère silicone Sylgard 184 est fourni sous forme de deux composants partie liquide, partie A et partie B. La partie A et la partie B sont mélangées dans un rapport de 10:1 en poids ou en volume. Après que les composants liquides sont mélangés, verser l'élastomère Sylgard dans une boîte de Pétri afin de couvrir toute la surface de la capsule. Quelques bulles d'air peuvent être présents que se dissipe pendant le processus de durcissement. Placez le couvercle sur la boîte de Pétri et laisser le elastomer à guérir. L'élastomère peut être durcie à température ambiante pendant 24 heures, ou à des températures élevées (par exemple 37 ° C) pour un séchage plus rapide. Une fois les composants liquides se solidifient, le plat dissection est prêt à l'emploi. Le plat peut être utilisé à plusieurs reprises pour des expériences multiples, à condition qu'elle soit bien nettoyée en suivant la procédure.
- Préparation de la pipette de micro-capillaire (aiguille). Micro-pipettes capillaires sont préparés en appliquant de la chaleur et tirez à l'aide d'un extracteur micropipette Narishige PC-10 vertical avec les paramètres suivants: Une étape traction; Heater # 2 réglé à 58, 100 g de poids de traction. La pointe fine de la micropipette est soigneusement cassé net à l'aide de fines pinces à # 55. Le diamètre moyen interne résultant de l'aiguille est de 85 um.
- Préparer l'ensemble de l'aspirateur pour aspirer le LCR. Insérez la micro-piston pourvue de micro-pipettes capillaires dans l'aiguille capillaire. En variante, fixer un filtre jetable en plastique à l'extrémité du tube d'aspiration qui est relié to la pipette micro-capillaire. Introduisez l'aiguille dans le joint en place à l'extrémité opposée de l'ensemble aspirateur.
- Transfert d'embryons isolés de la litière dans un plat micro-dissection préparé avec du Sylgard.
- Retirer les membranes extra-embryonnaires et des tissus pour que l'embryon est clairement exposée. Chaque tissu couche-première paroi utérine et l'. Decidua-peut être disséqué avec des ciseaux iridectomie fines (c.-à-Outils Fine Science # 15000-02) Au niveau de chaque site d'implantation, d'une part la paroi utérine, puis la caduque peut être incisé parallèlement à l'axe long de l'utérus, et de l'incision peut être ouverte à l'aide de pinces fines en outre. Le decidua peut être retiré après une incision similaire, exposer les membranes fœtales. Il faut être prudent afin que les membranes fœtales ne sont pas incisé ou perforé.
- Laver avec une solution saline stérile équilibrée de Hanks (HBSS) et retirer l'excès de liquide qui entoure l'embryon à l'aide d'une pipette et d'un filtre ou Kimwipepapier découpé en triangles.
2. Ventriculaire CSF Collection
- Visualisez embryon au microscope de dissection: pour la souris, l'embryon doit être couché sur le côté, de sorte que l'on a une vue sagittale de l'embryon en développement. Avec embryons de rat E16 ou plus, la position de l'embryon sur sa colonne vertébrale dorsale, le long de sa dimension la plus longue planaire, à partir d'un crâne de direction caudale, comme si l'embryon est couché sur le dos. De cette manière, le LCR peuvent être collectées à partir du ventricule latéral à droite et à gauche.
- Insérer progressivement la pipette micro-capillaire dans le ventricule latéral, mésencéphalique ventricule, ou grande citerne, en essayant de ne pas communiquer avec les cellules neuroépithéliales fois la pipette a été insérée. Pour les embryons de souris E14.5 ou plus, le CSF peut être aspiré dans le ventricule droit, puis l'aiguille enlevé et inséré dans le ventricule gauche. En raison de la perméabilité des ventricules et du tube neural chez les embryons de moins de E14.5, l'tout le volume de LCR peuvent souvent être aspiré dans les ventricules latéraux avec une insertion de l'aiguille unique. Cependant, ce n'est pas toujours le cas comme temps de développement et de perméabilité des ventricules de connexion peuvent varier légèrement, et, par conséquent, la pipette de micro-capillaire peut également être inséré dans la grande citerne pour recueillir le volume maximal CSF.
- Une fois la pipette de micro-capillaire est inséré dans le ventricule latéral, le ventricule mésencéphalique ou grande citerne, soigneusement et doucement commencer à aspirer le LCR dans la pipette, en utilisant le micro-piston pour créer une pression négative et aspirer le LCR, ou en fournissant une une légère pression négative créée par la bouche de telle sorte que le LCR commence à couler doucement dans la pipette de micro-capillaire d'une manière lente et contrôlée. Nous recommandons que le spectateur vérifie auprès de leurs propres responsables locaux en matière de politiques institutionnelles sur ces approches.
- Continuer à appliquer une pression négative et de recueillir le LCR dans la pipette de micro-capillaire.Dans les embryons de souris et le rat des deux E16.5/E17 ou moins, il est possible d'observer l'effondrement du ventricule légèrement par l'apparition d'une motte de terre formant sur le côté de la tête que la pipette de micro-capillaire est po En plus des embryons, en raison de la grande taille du cerveau, il peut ne pas être possible d'observer la tête de s'effondrer.
- Cesser d'appliquer la pression et retirez délicatement la pipette de micro-capillaire du ventricule latéral.
- Doucement expulser l'échantillon de LCR dans un tube Eppendorf qui a été refroidi sur glace.
- Continuer à recueillir le LCR d'une portée entière des animaux et mettre en commun les échantillons dans le même tube.
- Centrifuger à 10000 xg à 4 ° C pendant 10 min pour éliminer les cellules contaminantes.
- Analyser les échantillons pour détecter tout signe de contamination de cellules neuro-épithéliales ou de globules rouges. Des signes de contamination sont généralement indiqués par le fluide apparaissant trouble ou rouge / rose, ou la présence d'une pastille avec une tache traces de sang. Après centrifugation, le CSF peuvent être analysées au microscope pour toute preuve de cellules ou de débris cellulaires. S'il ya des signes de contamination du fluide doit être jeté. Comme contrôle supplémentaire, le contenu granulés peuvent aussi être colorés pour les cellules. Un échantillon propre CSF peut être utilisée pour la culture cellulaire, la culture corticale, spectrométrie, western blot, ELISA, et d'autres essais. Le liquide clair doit être transféré dans un tube Eppendorf stérile neuve. L'échantillon peut maintenant être utilisé pour l'analyse, mis en commun avec d'autres échantillons congelés ou pression avec de l'azote liquide et conservés à -80 ° C. Le gel et le dégel de petits échantillons de fluide peut entraîner une diminution de petit volume et les changements dans la concentration de protéines. Ceci peut être évité par lyophilisation des échantillons.
3. Dissection explantation corticale
- Transfert d'embryons E14.5 isolé de la litière dans un plat micro-dissection préparé avec du Sylgard.
- Retirer embryon de membranes extra-embryonnaires et des tissus tel que décrit à l'étape 1.5. <li> Laver stérile Hanks solution saline équilibrée de Hank (HBSS) et retirer l'excès de liquide qui entoure l'embryon à l'aide d'une pipette.
- Disséquer à travers la région cervicale séparer la tête du reste de l'embryon (figure 1A).
- Utilisation d'une amende de scalpel (couteau ophtalmique), coupé la ligne médiane du cuir chevelu. Saisissez chaque côté de l'incision avec des pinces fines et retirer la peau. Ensuite, utilisez des ciseaux iridectomie faire une incision qui s'étend le long de la ligne médiane du crâne en développement. Par la suite, faire deux incisions supplémentaires, environ 1/3 de la distance entre les extrémités antérieure et postérieure du crâne en développement. Utilisez une pince fine pour saisir les «volets» du crâne qui résultent de cette partie de la dissection, et enlever le tissu crâne en développement, exposant le cortex (figure 1B).
- En utilisant la bissectrice bistouri le long de la ligne médiane du cerveau dans le plan médian sagittal, séparant les hémisphères droit et gauche (figures corticales1B, C). La pie-mère et l'arachnoïde sont laissés attachés à la corticale et la dure-mère est enlevée avec le crâne en développement.
- Préparer chaque hémisphère cortical séparément. Placez le côté médial hémisphère de sorte que vous pouvez voir l'éminence ganglionnaire et le cortex en développement (figures 1C, D).
- En utilisant le scalpel, faire une incision coronale par le neuro-épithélium cortical caudale du bulbe olfactif développement. Cette incision doit commencer à la limite antérieure des éminences ganglionnaires latérales et médiales, et s'étendent à travers la région cingulaire antérieure du rudiment développement cortical (figure 1E).
- Faire une autre incision coronale juste à la limite caudale postérieur de l'éminence ganglionnaire latérale (figure 1F). Cette incision doit également s'étendre à partir de la limite latérale de l'éminence ganglionnaire de la paroi interne du rudiment développement cortical.
- Rentrer la corticale "flap" créationted par les deux incisions faites dans les étapes 3.7 et 3.8, à l'aide d'un scalpel ou d'une pression douce à partir d'un flux de HBSS livrés avec une pipette 200 ul d'éviter les dommages mécaniques au cortex. Ensuite, faire une incision transversale le long de la frontière qui sépare l'éminence ganglionnaire latérale du cortex en développement (figures 1G, H). Puis, disséquer loin de l'hippocampe et le développement de l'ourlet corticale médiale télencéphale, au sommet du néocortex où la surface latérale de la paroi corticale répond interhémisphérique.
- Faire une incision transversale le long de la frontière qui sépare l'éminence ganglionnaire latérale du cortex en développement (figure 1H).
- Retirez tout tissu supplémentaire qui est disséqué sur la plaque Sylgard de l'expiant disséqué corticale. On peut utiliser pipetage doux avec du tampon HBSS frais de pipeter loin n'importe quel tissu supplémentaire disséqués. Le cortex est disséqué maintenant avec le côté méningée vers le bas (Figure 1I).
- Préparer une boucle de fil de platine connecté à une pipette en verre. Chauffer la pipette en verre avec un fil de platine pliée insérée dans l'extrémité de la pipette en verre. En tournant l'extrémité de la boucle de fil de platine, la taille de la boucle peut être augmentée ou diminuée, et la boucle peut être mise en forme pour s'adapter à la taille désirée de l'explant. (Ceci peut être préparé à l'avance et réutilisés.)
- Chauffer l'extrémité du fil de platine de stériliser la boucle.
- Isoler l'explant disséqué corticale et retirez le support du HBSS supplémentaires par pipetage doux, en laissant une petite quantité à utiliser avec la boucle de fil.
- Placez une membrane de polycarbonate de 1 cm dans une boîte de 4 cm de diamètre imagerie.
- En utilisant le côté de la boucle de fil de platine, rabattez le cortex sorte que le côté méningée est orientée vers le haut.
- Lever l'explant corticale de la dissection plat, en plaçant l'explant dans le milieu de la boucle et en utilisant les forces hydrostatiques intrinsèqueslever l'explant sur un plan plat.
- Placer doucement l'explant sur la membrane de polycarbonate, et soulever la boucle de fil de platine de telle sorte que l'écart de l'explant reste sur la membrane sur une surface plane avec la surface ventriculaire en contact avec la membrane.
- Soulevez délicatement la membrane et pipeter 50 ul de LCR ou d'autres médias sous la membrane.
- Couvrir le plat d'imagerie, le placer dans un conteneur humidifié secondaire, et incuber à 37 ° C dans 5% de CO 2 pendant 24 h pour soutenir la prolifération cellulaire et la croissance des explants. La figure 2 montre un schéma de la préparation finale explant corticale plat.
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Representative Results
La collection CSF devrait produire un liquide clair, transparent. Il devrait y avoir aucune preuve de contamination par le sang, comme l'a démontré par un fluide teinté de rouge ou jaune dans l'aspiration et dans le tube Eppendorf. Il devrait également y avoir aucun signe de tissu dans l'aspiration et le tube Eppendorf. Lorsque le LCR est centrifugé, on peut aussi évaluer la LCR au microscope pour s'assurer qu'il n'ya pas de contamination. S'il ya des signes de contamination, le CSF doit être jeté. D'une portée de souris E14.5, on peut s'attendre à recueillir CSF 10-15 ul. Tableau 1 illustre les volumes moyens de LCR prélevés dans la taille des portées moyennes chez les souris et les rats des différents âges embryonnaires. Lorsque purs échantillons de LCR ont été recueillies, le CSF peut être analysée en utilisant un certain nombre de techniques différentes. La figure 3 montre un gel coloré à l'aide d'argent représentant 2ug de souris E14.5 CSF.
Cérébrales corticales explants peuvent être cultivés esprith des volumes variables de CSF ainsi qu'un milieu de base si nécessaire pour que le volume total est de 50 pi. La figure 4 montre explants cultivés représentatifs avec 50 pl de 100% embryonnaire CSF pendant 24 heures. Les explants ont été montré pour survivre et proliférer avec le CSF 100% et ont histologie des tissus semblables à des embryons de rongeurs au même âge gestationnel 9, comme indiqué par immunoréactivité à l'histone H3 phospho-(PH3), un marqueur de la division cellulaire, le long de la ventriculaire surface, BrdU, un marqueur de la synthèse de l'ADN, le long de la zone de l'incorporation du ventricule, et Tuj1, un marqueur neuronal, en développant la plaque corticale.
| Sprague Dawley litière embryonnaire Âge | Volume par portée | CD1 Âge litière embryonnaire | Volume par portée |
| E13 | 30-50 ul | E10.5 | 15-20 ul |
| E14 | 40-75 ul | E12.5 | 15-20 ul |
| E16 | 50-90 ul | E14.5 | 10-15 ul |
| E18 | 40-75 ul | E16.5 | Ul 5-10 |
Tableau 1. Volumes moyens des CSF par Standard Portées entreprises.
Figure 1. Schéma Décrivant cérébrale corticale Dissection explantation.
Figure 2. Schéma de Préparation de la vaisselle final.
Figure 3. Coloration à l'argent de la souris E14.5 CSF. C'est une médaille d'argent représentant tache de souris E14.5 2ug protéines dans le LCR fonctionner sur 4-12% Bis-Tris NuPAGE gel en gradient d'Invitrogen. Coloration à l'argent fait avec le kit de coloration à l'argent SilverQuest développé pour 5 min 40 sec.
Figure 4. E15 explants corticaux de rat cultivés pendant 24 h. Ce sont des images représentatives de explants cérébraux corticaux cultivés pendant 24 heures dans 100% embryonnaire CSF. Ces explants ont été corrigés par la méthode de Carnoy, de la paraffine en coupe, et préparé pour immunomarquage. PH3 (rouge), et Tuj1 (vert), BrdU (bleu).
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Discussion
La méthode décrite pour la collecte ventriculaire CSF a abouti à des échantillons relativement purs des embryonnaire CSF avec la composition protéique stable et cohérente dans l'activité d'un certain nombre de tests cellulaires 9. Avec une technique de collecte et de bonne taille de la portée de dix souris E14.5, on peut s'attendre à recueillir 10-15 ul de LCR, et d'une portée de rats E16, on peut s'attendre à recueillir environ 50-90 ul de LCR. Cette technique de collecte de minimiser la contamination du sang et des tissus, par une observation attentive, la centrifugation, et le rejet des échantillons présentant des signes de débris cellulaires ou teinte de sang. Nous avons analysé le liquide au microscope pour évaluer des débris cellulaires ou des cellules dans le LCR après centrifugation, et a constaté que les échantillons qui n'ont pas de culot après centrifugation sont exempts de contamination cellulaire. Contrairement à la protéomique des tissus du cerveau en développement ou à des échantillons de LCR contaminé (données non présentées), en utilisant cette méthode d'extraction CSF,le protéome du LCR ne contient pas de protéines mitochondriales lorsqu'ils sont analysés avec un spectromètre de masse 6.
Sur la base de la localisation physique de la LCR ventriculaire dans les vésicules télencéphaliques et tube neural, la seule méthode d'isolement est de percer la peau en développement, crâne, et le télencéphale. Par conséquent, l'insertion d'aiguilles à travers ces tissus est une source de contamination possible. La pointe de l'aiguille doit être aussi mince que possible, de telle sorte que l'aiguille peut être insérée facilement dans le tissu et dans le ventricule. La pipette micro-capillaire peut prélever des tissus à l'intérieur de l'alésage de l'aiguille lors de l'insertion de l'aiguille dans le ventricule. Selon l'âge de l'embryon, et si le plexus choroïde a développé dans le ventricule, il est important de ne pas aspirer le contenu du plexus choroïde dans la pipette. Cependant, il est important de créer suffisamment de pression négative, tels que le LCR recueille en til pipeter, sans perturber le tissu cérébral environnant développement ou du plexus choroïde. La présence d'une contamination des tissus peut être visualisée sous la loupe binoculaire, par pipetage CSF sur une lame de verre avec une lamelle de verre et de visualiser directement des débris cellulaires.
Les méthodes que nous décrivons pour l'isolement CSF fournir des échantillons relativement purs de CSF comme nous l'avons décidé à ce jour. Lorsqu'ils sont connus échantillons de LCR contaminés ont été analysés par spectrométrie de masse, ils ont révélé la présence de protéines mitochondriales (données non présentées). Un défaut inhérent à la technique est que le CSF est obtenu par ponction du crâne développement et le cortex, et par conséquent, les cellules et les tissus peuvent être présentes dans le LCR. Par centrifugation du LCR, le dosage pour une pastille, et microscopiquement l'analyse de la CSF sous le microscope, nous avons optimisé une méthode pour isoler CSF qui donne des échantillons relativement purs de CSF.
La technique de fou ventriculaire embryonnaire CSF collecte et cérébrales corticales explants a été décrite et représentée dans le film d'un embryon de souris. Cependant, cette technique peut être utilisée pour la collecte du LCR ventriculaire et cérébrales corticales explants de tous les rongeurs embryonnaires et a été appliqué à des rats et des souris. La méthode décrite dans ce protocole a été conçu spécifiquement pour l'isolement du LCR ventriculaire, et n'est pas destiné à la collecte du LCR dans l'espace sous-arachnoïdien.
La technique de explants cérébraux corticaux a été créé pour être en mesure de développer des explants avec un volume réduit des médias, compte tenu des quantités limitées de CSF embryonnaire disponible pour des expériences individuelles. Le plus petit volume de milieu utilisé pour la culture des explants de manière fiable pendant 24 heures était de 50 ul. De temps en temps, les explants ont été cultivés pendant plus de 24 heures, la plus longue période étant de 72 heures. Avec plus d'expériences, il est préférable de compléter les milieux de croissance chaque h 24. Une fois les explants are cultivées pendant la période de temps désirée, les explants peuvent être utilisées pour un certain nombre de tests différents, y compris immunofluorescence, générant neurosphères, la mort cellulaire, ou l'extraction d'ARN.
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Disclosures
Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts financiers.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants du soutien du NIH (numéros d'attribution R00 NS072192 à MKL, HD029178 à AS.L., et 2 RO1 NS032457 des TCA). MKL est le récipiendaire de l'Hôpital pour enfants de Boston carrière Développement Bourse Bourse / Harvard Medical School et Rive Fellow de la Fondation Alfred P. Sloan. TCA est un chercheur de l'Institut médical Howard Hughes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wiretrop II capillary needles | Drummond Scientific | #5-000-2020 | |
| Sylgard | Ellsworth Adhesives | #184 SIL ELAST kit | |
| Aspirator tube assembly | Sigma | #A5177-5EA | |
| Disposable filter | Venturi or local pharmacy | not available | Standard cigarette filter |
| Roundstock opthalmic knife (15 degree stab knife) | World Precision Instruments, Inc. | #500250 | |
| 35mm glass bottomed culture dish | MatTek Corp. | #P35G-1.5-14-C | |
| Platinum-iridium wire | Tritech Research | #PT-9010-010-3FT | |
| Nuclepore Track-Etch Membrane | Whatman | #09-300-57 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Fisher Scientific | #SH30031.FS | |
| Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | #15000-02 |
References
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