Abstract
Immunhistokemi (IHC) giver meget specifik, pålidelig og attraktiv protein visualisering. Korrekt udførelse og fortolkning af en IHC-baserede flerfarvet mærkning er udfordrende, især når de anvendes til vurdering sammenhængen mellem målproteiner i vævet med et højt fedtindhold, såsom centralnervesystemet (CNS).
Vores protokol udgør en videreudvikling af standarden immunolabeling teknik særligt tilpasset til påvisning af både strukturelle og opløselige proteiner i rotte CNS og perifere lymfeknuder (LN), der berøres af neuroinflammation. Ikke desto mindre, med eller uden yderligere modifikationer, vores protokol kunne sandsynligvis anvendes til påvisning af andre relaterede protein-targets, endog i andre organer og arter end her fremlagt.
Introduction
Trods anvendelsen af avanceret high-throughput analyser udføres på methylome, transkriptomet eller endda proteom niveau, immunfarvning forbliver den gyldne standard for protein detektion direkte i vævsprøven, cellekultur eller en celle smear. Ved at afsløre mønster lokalisering / distribution, kan immunhistokemi (IHC) vurdere relative forhold og topografiske indbyrdes af målproteiner, og selv angive deres biologiske aktiviteter. Derfor er IHC almindeligt brugt til kliniske og forskningsmæssige formål, f.eks, til diagnose, behandling evalueringer, undersøgelse af sygdomsmekanismer, funktionelle og fænotypiske ændringer i dyremodeller mv
Væsentlige omfatter histologi, patologi, biokemi og immunologi, har IHC betydeligt fremskridt siden 1941, hvor fluorescerende mærkede antistoffer blev anvendt for første gang for at identificere Pneumokok antigener i inficerede væv 1. Visualization af cellulære produkter og komponenter ved IHC er baseret på binding af antistoffer (Abs) til deres respektive antigen (Ag). Ud over anvendelse af fluorofor mærkede antistoffer, kan immunreaktioner også visualiseres ved anvendelse af enzymer som peroxidase 2,3 eller alkalisk phosphatase 4. Endvidere er kolloidt guld-tagget antistoffer 5 anvendes til påvisning af specifikke antigen-antistof-interaktion af både lys- og elektronmikroskopi, mens radioaktive mærker er visualiseret ved autoradiografi.
Ag-Ab immunreaktion kan påvises via direkte og indirekte metoder. Den direkte metode er i det væsentlige hurtigere og enklere, som det anvender direkte mærket primær Abs 6. Men på grund af betydelig mangel på sensitivitet, er indirekte metoder foretrækkes til de direkte dem. To-trins indirekte påvisning procedurer kræver umærket primære Abs, som det første, og mærket sekundært Ab'er rettet mod den primære Abs, som det andet lag 7.Signalforstærkning kan opnås ved at involvere yderligere, enzym-koblet tertiær Ab (tre-trins indirekte metode), der binder til sekundære Ab. Almindeligt anvendte indirekte detektionsmetoder er avidin-biotin og peroxidase-antiperoxidase (PAP). Alternativt kan alkalisk phosphatase-antialkaline phosphatase (APAAP) komplekset anvendes i stedet for PAP-metoden. Især alkalisk phosphatase (AP) metoder synes at være endnu mere følsomme end immunoperoxidase metoder 4. Avidin-biotin-kompleks (ABC) metode bruger biotinyleret sekundært Ab i kombination med enten avidin-biotin-kompleks (LAB), eller mærket streptavidin-biotin-kompleks (SLAB). Følsomhed Detection kan øges yderligere ved at inddrage avidin mærket med peroxidase eller alkalisk phosphatase 8. Andre metoder til påvisning i brug er polymere mærkning, tyramin forstærkning og immuno-rullende cirkel 9. Især kan forskellige påvisningsmetoder kombineres for multipel Ag detektion i det samme vævprøve, som blev rapporteret for første gang i 1978 4. Samtidig dobbelt immunfarvning præsenteres her blev udført i formalin-fikseret, paraffin-indlejret rotte CNS og LN vævssnit ved hjælp peroxidase-bundne og AP-konjugerede sekundære antistoffer, hhv. Signalerne blev visualiseret ved hjælp af 3,3'-diaminobencidine (DAB) kromogen og Fast Blue (FB) APAAP kompleks henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etisk Statement
Present undersøgelse udføres i overensstemmelse med retningslinjerne fra den svenske National Board for forsøgsdyr og Det Europæiske Fællesskab Rådets direktiv (86/609 / EØF) under de etiske tilladelser N338 / 09, N15 / 10 og N65 / 10, som blev godkendt af North Stockholm Animal Ethics Committee.
1. Vævspræparat
- Perfusion & fiksering
- Bedøver dyret med isofluran til at udføre transcardial perfusion via venstre ventrikel. Indlede skylning af vaskulatur med phosphatbufret saltvand (PBS) for at fjerne de blodkomponenter, efterfulgt af 4% paraformaldehyd i 0,1 M PBS (PFA).
- Fiksere dissekeret hjerner, rygmarv og perifere LN væv ved at nedsænke i PFA. Efter 24 timer ved 4 ° C, overføres vævet fra PFA i PBS og opbevares ved 4 ° C indtil yderligere forarbejdning. Alternativt til kommerciel PBS opløses 9 g NaCl i 250 ml af S &# 246; Sørensen buffer, og der tilsættes 750 ml deioniseret vand (dH 2 O); at forberede 0,2 M Sørensen-puffer (pH 7,4) opløses 13,8 g NaH 2 PO 4 x 1 H 2 O og 71,2 g Na 2 HPO 4 x 2H 2 O i 2,5 L dH 2 O.
- Dehydrering & indlejring
- Skær vævet ind ca. 5 mm tykke dele ved hjælp af et barberblad.
- Indlede vævet hærdningsprocessen (dehydrering) ved hjælp af Tissue-Tek VIP Vacuum Infiltration Processor (standard procedure baseret på nedsænkning i stigende koncentrationer af ethanol efterfulgt af xylen og endelig paraffin (tabel 1).
- Placer væv i en form og hæld i flydende paraffin omkring prøven til dannelse af en "paraffin blok". Langsigtet opbevaring kræver stuetemperatur (RT). Men før sektionering, er det anbefalelsesværdigt at afkøle blokkene, f.eks natten over (o / n) ved 4 ° C.
2. Sektionsinddeling
- Placer paraffin blok ind i en fast holder af slæden mikrotom, der kan bevæge sig frem og tilbage over kniven. Juster optimale vinklen mellem klodsen og mikrotomen kniv (der afhænger af kniv geometri, men også på skærehastighed og teknik).
- Skær 3 - 5 um tykke tværsnit fra paraffin blok.
- Overfør bare skære sektion i en vandbeholder og montere den efterfølgende fra vand på objektglasset.
- Tryk på monterede afsnit omhyggeligt mod en papirserviet for at fjerne resterende vand og potentielle luftbobler. Kommercielt præ-coatede selvklæbende objektglas er anbefalelsesværdigt.
- Tør monterede dias i et par timer i en ovn på 50-60 ° C.
3. Afparaffinering (Rehydrering & Blokering af Endogen peroxidase)
- Fordyb dias 2x i xylen (alternativt xylen erstatningXEM-200), hver ibrugtagning 15 - 20 '.
- Skyl i 99% ethanol.
- At blokere endogen peroxidaseaktivitet, inkuberes snittene i 30 'i methanolopløsning indeholdende 0,25% hydrogenperoxid.
- Fortsæt rehydrering ved anvendelse af ethanol med stigende vandindhold (99%, 70%, ender i destilleret vand.
- Fra dette punkt, indtil montering af dækglas sektioner skal holdes fugtig.
4. Antigen Retrieval
- Brug en fødevare damper til kogning objektglassene i et antigen hentning opløsning (i dette tilfælde EDTA pH 8,5 buffer) for 60 '(EDTA buffer stamopløsning indeholder 1,21 g Tris og 0,37 g EDTA opløst i 50 ml dH2O; at forberede arbejdsmiljøet løsning fortyndet 2,5 ml EDTA-stamopløsning i 47,5 ml dH 2 O).
- Køl ned dias på RT i ca. 1 time og derefter skylles 3 - 5x med Tris saltvand (TBS, brug alternativt PBS), der består af 0,05 M Tris og 0,15 M NaCl; pH 7,5 justeret with HCI. Alternativt kan kommerciel TBS.
5. Blokering af uspecifik binding steder
- At undgå uspecifikke baggrund reaktioner, inkuber afsnittene om stuetemperatur i 30 'i blokeringsopløsning indeholdende 10% føtalt kalveserum (FCS) og 90% DAKO puffer.
6. Dobbeltklik immunolabeling: Samtidig Inkubation med de primære Abs
- Fortynd nødvendige mængde af primære antistoffer i blokeringsopløsningen og inkuber o / n ved 4 ° C. For den dobbelte immunfarvning kombinere α-eotaxin (Ccl11; 1: 300) med α-CD68 (ED1; 1: 1000) eller α-Iba1 (Aif1, 1: 1000) eller α-CD8a (Ox-8; 1: 200) .
- Skyl slides 3-5 gange med TBS buffer (brug alternativt 10x fortyndet DAKO buffer).
- Fortynd nødvendige mængde af sekundære antistoffer (biotinyleret anti-ged og AP-konjugeret anti-mus, både 1: 200) i blokerende opløsning og inkuber 1 time på RT.
- Skyl dias 3 - 5x med TBS buffer (ose alternativt 10x fortyndet DAKO puffer).
- Glassene inkuberes tildækket med avidin-peberrodsperoxidase-kompleks (HRP) fortyndet i blokeringsopløsningen i 1 time på RT.
- Skyl dias 3 - 5x med TBS buffer (brug alternativt 10x fortyndet DAKO buffer).
7. Visualisering
- Visualisering af det bundne AP-mærket sekundært antistof
- Forbered 0,1 M Tris-HCI-buffer ved opløsning 12,1 g Tris i 1 L dH2O og justere pH til ved hjælp af HCI. Brug samme Tris-HCI-buffer at forberede 1 M levamisol opløsning. Forbered frisk 4% NaNO2 løsning i dH 2 O.
- For at opnå 50 ml af Fast Blue (FB) substrat (volumen kræves til en standard glaskuvette) opløses 6,25 mg Naphtol-AS-MX-phosphat i 312,5 pi DMF i glasrøret og rør i 50 ml foropvarmet (37 ° C) Tris-HCI-buffer. For at opløse 12,5 mg FB RR Salt i 312,5 pi 2 N HCI tilsættes 312,5 pi tidligere preparød 4% NaNO2-opløsning og omrør blandingen i de samme 50 ml forvarmet Tris-HCI-buffer. Ryst let, indtil den gule væske bliver klar og endelig tilføje 77 ul tidligere fremstillede en M Levamisol løsning. Filtrat opnåede blanding og hæld på objektglas placeret i glaskuvette.
- Indlede inkubation ved 37 ° C og styre udviklingen proces under lysmikroskop ca.. hver 15 - 30 min. Hvis drejning fuzzy, udskifte FB løsning med den friske blanding.
- Skyl dias 3 - 5x med TBS buffer og overførsel efterfølgende ind i PBS-buffer.
- Visualisering af det bundne biotinylerede sekundære antistof
- Forbered DAB / H2O 2 fremkalderopløsning ved at fortynde 1 ml DAB stamopløsning (25 mg DAB hvert 1. ml PBS) i 49 ml PBS. Tilføj 16.5 pi H2O 2 og filtrat før udhældning på sektioner.
- Konvertering af chromogen DAB til fældning af panden pigment kan være øjeblikkelig. Styre udviklingsprocessen under lysmikroskop (selv par sekunder længere inkubation kan hæve en høj baggrund og maskere specifikt signal).
- Intensiteten af den brune pigment bundfald kan alternativt forøges ved inkubering i opløsning bestående af 2% kobbersulfat og 0,9% NaCl i 5 '.
- Skyl dias 3 - 5x med PBS og til sidst med dH 2 O, brug alternativt postevand.
- Monter dias med dækglas direkte fra vandet ved hjælp af vandigt GelTol montering medium. Undgå at skabe luftbobler.
- Tillade fuldstændig tørring af monteringsmedium, fx o / n ved 4 ° C. Store tørrede slides på RT.
| 1. | % Ethanol | 20 ' | 40 ° C |
| 2. | % Ethanol | 60 &# 39; | 40 ° C |
| 3. | % Ethanol | 90 ' | 40 ° C |
| Fire. | % Ethanol | 60 ' | 40 ° C |
| Fem. | % Ethanol | 90 ' | 40 ° C |
| 6. | % Ethanol | 60 ' | 40 ° C |
| 7. | % Ethanol | 90 ' | 40 ° C |
| 8. | % Ethanol | 120 ' | 40 ° C |
| 9. | xylen | 30 ' | 40 ° C |
| 10. | xylen | 60 ' | 40 ° C |
| 11. | paraffin | 60 ' | 60 ° C |
| 12. | paraffin | 60 ' | 60 ° C |
| 13. | paraffin | 60 ' | 60 ° C |
| 14. | paraffin | 120 ' | 60 ° C |
Tabel 1. Tissue Behandling af Tissue-Tek VIP Vacuum Infiltration Processor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dobbelt immunfarvninger (co-farvninger) blev udført i formalin-fikseret, paraffin-indlejret rotte CNS og LN sektioner. 3-5 um tykke vævssnit blev skåret under anvendelse af en slæde mikrotom, monteret senere på præcoatede klæbende objektglas og behandlet som tidligere beskrevet 10,11,12. Kort fortalt, efter deparaffinizing, væv rehydrering og endogen peroxidase inaktivering blev snit underkastet antigenet hentning proces, efterfulgt af et blokerende trin til at eliminere uspecifikke bindingssteder. Co-farvninger blev udført i følgende kombinationer: i) Ccl11 / Iba-1, ii) Ccl11 / ED1 og iii) Ccl11 / CD8. Den primære Abs anvendes til hver co-farvning er blevet rejst under to forskellige arter (ged og mus, henholdsvis), som gjorde det muligt deres samtidige inkubation. Ccl11 blev visualiseret ved den brune peroxidase reaktionsproduktet, mens Iba-1, ED1 og CD8, blev visualiseret ved den blå AP signal.
10. Ifølge IHC analyser udført i rotter CNS, Ccl11 var til stede i pericarya, dendritter og axoner af neuronerne beliggende i de ventrale horn i rygmarven grå substans (figur 1A og B). Endvidere enkelt Ccl11 + plasmaceller var påviselige i de samme vævssnit (figur 1A), samt enkelt Ccl11 + / ED1 + makrofager og hjerne residente mikroglia observeret ved inflammationsstedet (data ikke vist, ED1 er en markør for lysosomalt protein i aktiverede makrofager og mikroglia 13). Især blev Ccl11 kemokin ikke fundet co-lokalisere med Iba-1 + makrofager og hjerne residente mikroglia (1A; Iba-1 er en markør til påvisning af ioniserede Ca2 + -bindi ng protein 14).
IHC-baserede proteinmålrettede udført i det perifere rotte LN udviste Ccl11 protein co-lokalisering med ED1 (figur 2B). Men ingen Ccl11-udskillende CD8 + T-lymfocytter var påviselige i de samme vævssnit (figur 2A; CD8 + celler blev detekteret ved anvendelse af anti-CD8a, markør for overvejende cytotoksiske T-celler, som binder til MHC klasse I molekyler 15). Bortset udelade primære Abs under o / n inkubering i blokeringsopløsningen blev kontrolsnit behandlet som beskrevet i protokollen. Ingen afsløring signaler målet proteiner (som præsenteret i figur 1A, B og 2A, B) blev observeret i CNS og LN kontrol sektioner (figur 1C og 2C, henholdsvis).
s / ftp_upload / 50.425 / 50425fig1.jpg "/>
Figur 1. A, B: Dobbelt Immunfarvning i Rat LN. Primære antistoffer rettet mod Ccl11 kemokin i kombination med enten α-CD8 (A) eller ED1 (B). Nr co-lokalisering inden for den samme celle blev observeret for Ccl11 + (brun) og CD8 + celler (blå) B:. Ccl11 detektionssignal (brun) co-lokalisere med markøren for et lysosomalt protein i makrofager (ED1, blå). C: Negativ kontrol; en detalje, der viser umærkede hjemmehørende celler i det perifere LN. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. A, B: Dobbelt Immunfarvning i Rat SPinal Cord. Ventrale horn af den grå substans udstille Ccl11 i neuronale pericarya, dendritter og axoner (brun) co-farvet med enten Iba-1 + (A, blå) eller ED1 + (B; blå) makrofager / microglia celler C:. Negativ kontrol; en detalje, der viser umærkede hjemmehørende celler i den ventrale horn af rygmarven grå substans. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Standard IHC procedurer kræver ofte specifikke justeringer for at opnå et optimalt resultat, hvilket almindeligvis indebærer omfattende erfaring, men også "trial and error" tilgang. Fra forberedelse væv indtil målet visualisering, kan næsten hvert trin i protokollen blive udsat for individuelt designede ændringer for at forbedre det endelige resultat. Dobbelt farvningsprotokol præsenteres her eksemplificerer IHC-baserede protein rettet mod specielt justeret til at vurdere sammenhængen mellem målet proteiner af vores interesse i formalin-fikseret, paraffin-indlejret rotte CNS og LN vævssnit ramt af neuroinflammation. Som sådan kan den bruges som en tutorial til at lære teknikken IHC, men også som en kilde til inspiration for mere avancerede forsøg. Imidlertid skal det holdes for øje, at en simpel reproduktion af denne protokol til at målrette andre proteiner og / eller i andre væv end her præsenteres, kan generere suboptimale resultater.
In situ-hybridisering under anvendelse låst nukleinsyre (LNA) riboprobe mod Ccl11 udviste opregulering af de respektive mRNA-niveauer i CNS af kongene rottestammen 10. Dette resultat blev bekræftet af qPCR analyser. Endvidere qPCR afslørede Ccl11 opregulering også i kongene perifere LN sammenlignet med vildtype (wt) stamme. Endelig Western Blot (WB) viste signifikant opregulering af Ccl11 proteinet i begge målvæv på sygdommen-beskyttede kongene rotte stamme 10. Derfor vi havde til formål at undersøge oprindelsen af dette chemokin direkte i målvæv, og til det formål har vi udviklet den her beskrevne dobbelt farvning protokol.
Udover at undgå mekanisk beskadigelse af vævet under dissektion post mortem og post-fiksering afkalkning, kan væv sektionering synes ganske udfordrende. Den sektionering normalt kræver dygtighed og praksis. Kvaliteten af skive er afhængig af mange aspekter such som justering af en ret vinkel mellem vævsblokken og kniven for at reducere trykket påført på prøven under skæring, kan skæring hastighed osv tykkelse af paraffin-indlejrede vævssnit fremstillet ved slæde mikrotom varierer fra 2 til 50 um. Skær paraffin vævssnit er monteret fra et varmt vandbad på objektglas fortrinsvis kommercielt belagt med et klæbemiddel, såsom poly-L-lysin eller aminopropyltriethoxysilan (APTS) for at sikre en bedre greb under krævende farvning procedure. I modsætning til kryo vævssnit som er skåret ved ca. -20 ° C ved anvendelse cryomicrotome og tørret ved stuetemperatur før farvningen, afkølet paraffinblokke er skåret ved stuetemperatur, og efterfølgende tørret ved 50- 60 ° C før Afparaffinering.
Meget bevarede væv arkitektur, celle morfologi og målepitoper er afgørende for vurderingen af lokalisering og indbyrdes relationer for målet proteiner. For at opnå optimal væv presertion, prøver at blive rettet, enten ved hjælp koagulerende eller cross-linking fikseringsmidler. Koagulerende fikseringsmidler, såsom ethanol, anvendes oftest til kryopræservering. Proteindenaturering under anvendelse af ethanol opnås gennem væv dehydrering 9; hvilket kan resultere i utilstrækkelig cellulær konservering 16. I modsætning til koagulerende fikseringsmidler, formaldehyd er en tværbindende fiksativ, som oftest anvendes i rutinemæssige histologi og IHC 9 for både fryselagring og paraffin vævskonservering. Vi har opnået en optimal fiksering for rotte CNS og LN ved at nedsænke i formaldehydopløsning i 24 timer ved 4 ° C før afkalkning og efterfølgende paraffinindlejring. Trods medfører gennemgribende ændringer i kropsbygning af makromolekyler (formaldehyd nemlig danner methylen broer, der tværbinder proteiner og derved maskerer antigener, der kan forhindre specifik binding af antistoffer), denne semi-reversible, kovalente reagens giver høj kvaliity vævskonservering. Især kan temperatur og varighed af fiksering med tværbindingsreagenser påvirke flere aspekter af IHC såsom sektionering, epitop afsløring og endda krydsreaktivitet. Således både under-fiksering og over-fiksering under anvendelse aldehyd-baserede reagenser såsom formaldehyd kan forårsage artefakter, der primært skyldes autolyse eller overdrevne tværbindinger 17 hhv. Ikke desto mindre kan en uspecifik baggrundsfarvning grund hydrofobt protein binding observeret af overfixation reduceres under anvendelse af lave saltede puffere indeholdende ioniske detergenter, eller ved at øge pH af fortyndingen stødpude ved anvendelse af polyklonale Abs 18. Imidlertid kunne en uspecifik baggrundsfarvning (støj) forårsaget af ioniske og elektrostatiske proteininteraktioner reduceres under anvendelse fortyndende puffere med høj ionstyrke, der samtidig kan forværre støj forårsaget af hydrofob proteinbinding 18. Når det kommer til påvisning af mål-epitoper, formaldehyd-induced ændring af den tertiære struktur af proteiner kan være, men ikke udelukkende, vendes ved antigen-genvinding 19: i) ved opvarmning i buffere med forskellige pH-værdier (varmeinduceret epitopgenfinding (HIER), ii) ved enzymatisk nedbrydning (protease-induceret epitopgenfinding (PIER; 20)), iii) ved inkubering i stærk basisk eller sur opløsning, eller saccharose 21, 22 eller iiii) ved behandling med koncentreret myresyre 23. HIER vises bekvemt for størstedelen af målepitoper 19. Udover opvarmningsvarighed, kan pH-værdien af opløsningerne såsom EDTA (pH 5,5, 8,5 eller 9,0) eller natriumcitratpuffer (pH 6.0- 6.2) være afgørende for resultatet af HIER. Især blev den mest tilfredsstillende resultat i vores undersøgelse opnås ved dampning prøverne i 1 time i EDTA-opløsning med pH-værdi 8,5.
Selvom antistoffer binder fortrinsvis til deres specifikke epitoper, tiltrækning til ikke-specifik, svarende til den beslægtede Ag bindingsites, kan ikke helt udelukkes. Især sandsynligvis den mest effektive fremgangsmåde til reduktion af baggrundsfarvning er inkubering i blokerende proteiner (såsom FCS anvendes i vores undersøgelse) forud for anvendelsen af den primære Abs 9. Monoklonale primære Abs er alligevel foretrækkes frem polyklonale Abs som følge af højere specificitet og derved reduceret uspecifik baggrund signal. Alligevel krydsreaktivitet stadig kan forekomme, som monoklonale Ab'er er rettet mod epitoper almindeligvis består af et lille antal aminosyrer, som kan være en del af en anden (uspecifik) protein 24. I modsætning monoklonale, polyklonale Ab'er har en større chance for at genkende flere isoformer af målproteinet. Vi brugte oprindeligt to forskellige primære Abs at opdage Ccl11: i) et polyklonalt rejst i ged og ii) et monoklonalt rejst i mus. I vores hænder, begge produkter udstillet samme farvningsmønster for målet chemokin. For at udføre samtidige co-farvning, anvendte vi gede-anti rotte CCL11 Ab i kombination med antistofferne mod Iba-1, ED1 og CD8 henholdsvis som alle blev produceret i mus. Desto mindre, foruden samtidigt, dobbelt immunfarvning kan også udføres sekventielt 25, som det kræves til co-mærkning af den primære Ab'er produceres i de samme arter.
Den optimale arbejdsforhold koncentration af Ab'er anvendes i vores undersøgelse blev foretaget via test-fortyndingsrække som et optimalt forhold mellem intensiteten af det specifikke signal og baggrundsstøj. Imidlertid bør det holdes for øje, at en optimal bearbejdning koncentration af det samme antistof undertiden variere mellem organerne, arter, baggrund patologi, etc. Især blev permeabilisering ikke nødvendige i vores farvning procedure udført i paraffinindlejret, 3-5 um tykke vævssnit imidlertid detergenter såsom Triton X-100 kunne stadig have været brugt til at reducere overfladespændingen og således lette bindingen mellem antigen og antistof. På denTværtimod permeabilization- medieret forbedring af Ab penetration behov for på protein detektion i dyrkede celler eller cellesuspensioner (immuncytokemi (ICC)), for immunfluorescens (IF) i Cryo afsnit og IHC / IF i frisk (tyk, vibratome-cut) frit flydende vævssnit.
Gentagen kontrol er hovedsagelig vigtigt til generering specifikke / pålidelig immunotargeting. Som en positiv kontrol anvendte vi lunger fra en rotte model af astma, hvor vi kunne detektere Ccl11 + eosinofiler. De negative kontroller blev inkuberet kun i blokeringsopløsningen o / n ved 4 ° C i fravær af den primære Abs.
Vi har allerede nævnt nogle årsager og mulige løsninger til reduktion af en baggrund signal. En uspecifik immunfarvning produkt kan også forekomme som reaktion mellem DAB og pseudoperoxidaseaktivitet af de røde blodlegemer og peroxidase af de myeloide celler 26. Aktivitet af disse enzymer, blot som støj caused af endogen biotin eller AP er allerede blevet reduceret i formalin-fiksering. Imidlertid forbehandling med methanol / H2O 2 er nødvendig for deres videre eller fuldstændig inaktivering 27, 28. Baggrundspletning forårsaget af AP-aktivitet i pattedyrvæv kan yderligere inhiberes af levamisol 29, eller ved eddikesyre 29. Uspecifik binding som resultat af ionisk tiltrækning mellem avidin og modsat ladede cellulære molekyler 30 kan undgås ved at substituere avidin fra æggehvide med streptavidin fra Streptomyces avidinii 31.
DAB er nok det mest anvendte chromogen i IHC. Udover DAB (brun reaktionsprodukt), andre peroxidase chromogener i brug er 3-amino-9-ethylcarbazol (AEC, rød), 4-Chlor-1-naphthol (CN, blå) og tetramethylbenzidin (TMB, blå). Almindeligt valgte AP chromogener er FB, Fast Red (FR), ny fuchsin og 5-brom-4-chlor-3-indolylphosphat / nitro blue tetrazoliumchlorid (BCIP / NBT). Valget af enzymer og chromogener er grundlæggende et spørgsmål om individuelle præferencer, kan det imidlertid blive styret af mål-funktioner såsom lokalisering, ekspressionsmønster, men også ved tilstedeværelsen af endogene pigmenter (melanin, hæmosiderin) 32. Counterstain er det sidste, fakultative trin i IHC procedure normalt udføres ved hjælp af hæmatoxylin, nuklear hurtig rød eller methyl grøn 18. Generelt mere egnet til enkelt mærkning, kontrastfarve letter fortolkningen af væv morfologi og det bør subtilt udviklet for at undgå enhver interferens med chromogen bundfald.
Ved afslutningen af farvningsproceduren vævssnit bør omhyggeligt monteres med et dækglas under anvendelse af et monteringsmedium. bør undgås dannelse af luftbobler. Udover fysisk beskyttelse, montering medium forbedrer visualisering og kvaliteten af billedbehandling. Enten organisk / hydrofob eller vandig / hydrofil, CHOICE af monteringselementet medium afhængig opløselighed af slutproduktet i det organiske opløsningsmiddel. Mens en toluen- baseret monteringsmedium ville være egnet, fx til DAB, kan vandigt monteringsmedium anvendes på alle enzymatiske chromogener, herunder fluorescens mærkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) | Baxter | 1001936060 | Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment. |
| Sodiumchloride (NaCl) | Merck | 1.0604 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% in 1x PBS | Apl pharma | 34 24 28 | Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity. |
| Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) | Sigma-Aldrich | 459844-1L | Flamable. |
| Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 | Sigma-Aldrich | 534056 | Flamable. Acute toxicity. |
| Histo-Comp Paraffin Wax | Tissue-Tek | V0-5-1001 | |
| Adhesive Microscope Slides | Starfrost | MIC-1040-W | |
| Xylol substitute XEM-200 | Vogel GmbH | ND-HS-200 | Respiratory sensitization. Carcinogenicity. |
| α-CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA48G | |
| α-Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody | Millipore | MABN92 | |
| α-CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA341R | |
| α-eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody | Santa Cruz BT | SC-6181 | |
| Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody | Dakopatts, Denmark | D0314 | |
| Biotinylated secondary antibody | Amersham Biotech | RPN1025 | |
| Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) | Sigma-Aldrich | A3151 | |
| Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) | Sigma-Aldrich | N4875-1G | Acute toxicity. |
| Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) | Sigma-Aldrich | FBS25 | |
| Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) | Sigma-Aldrich | 31742 | Acute toxicity. |
| 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) | DAKO | S3000 | Highly flammable. Toxic. |
| Copper sulphate (CuSO4) | Merck | 1.02791 | Acute toxicity. Environmental hazzard. |
| GelTol Aqueous Mounting Medium | Thermo Electron Corporation | 230100 | |
| Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) | Merck | 107210 | Acute toxicity. |
| Methanol (CH3OH) | Fluka | 65543 | Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable. |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) | AppliChem | A1379 | Skin and eye irritation. |
| Tris Buffered Saline (TBS), tablet | Sigma-Aldrich | T5030 | |
| Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) | Merck | 1.0658 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) | Merck | 1.06346 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Cambrex BioScience | DE-14-802F | |
| DAKO cytomation wash buffer 10x | DAKO | S3006 | Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming. |
| N,N-Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) | Fluka | 40250 | Flammable. Acute toxicity. |
| Glas coverslips 24 x 36 mm | Menzel-Gläser | BB024036A1 | |
| Hydrochloric acid, conc. (HCl) | Sigma-Aldrich | 30721 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Hydrochloric acid solution volumetric, 2 M HCl (2 N) | Fluka | 71826 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) | Sigma-Aldrich | S2252 | Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment. |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) | Merck | 1.08454 | Oral exposures may cause reproductive and developmental effects. |
| Equipment | |||
| Tissue-TekV.I.P Vacuum Infiltration Processor | Sakura | 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz | |
| Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome | Hacker instruments | ||
| Household food steamer | Braun | MultiGourmet FS 20 | |
| Light microscope | Leica Polyvar 2 | ||
References
- Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
- Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).
- Mason, D. Y., Sammons, R. Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use. Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).
- Polak, J. M., Van Noorden, S. Introduction to immunocytochemistry. , Bios Scientific Publishers Ltd. Oxford, UK. (2003).
- Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods. American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).
- Ramos-Vara, J. A.
- Adzemovic, M. Z., et al. Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats. PloS one. 7, 39794 (2012).
- Bauer, J., et al. Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes. Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).
- Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord. The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).
- Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).
- Hirasawa, T., et al. Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice. Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).
- Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules. Nature. 336, 79-81 (1988).
- Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).
- Hayat, M. Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy. , Kluwer Academic. New York. (2002).
- Boenisch, T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).
- Huang, S. N. Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).
- Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).
- Taylor, C. R., Shi, S. R. Antigen retrieval: call for a return to first principles. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).
- Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).
- Nelson, P. N., et al.
- Van der Loos, C. Immunoenzyme multiple staining methods. , Bios Scientifc publishers Ltd. New York. (1999).
- Elias, J. Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis. , ASCP Press. Chicago. (2003).
- Straus, W. Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).
- Streefkerk, J. G. Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).
- Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).
- Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones. Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).
- Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells. The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
