Abstract
Immunhistokjemi (IHC) gir svært spesifikk, pålitelig og attraktiv protein visualisering. Riktig ytelse og tolkning av en IHC-basert flerfarget merking er utfordrende, spesielt når det brukes for å vurdere sammenhengene mellom target proteiner i vev med høyt fettinnhold som sentralnervesystemet (CNS).
Vår protokoll representerer en videreutvikling av standard immunolabeling teknikk spesielt justert for deteksjon av både strukturelle og løselige proteiner i rotte CNS og perifere lymfeknuter (LN) rammet av nevroinflammasjon. Ikke desto mindre, med eller uten ytterligere modifikasjoner, vår protokoll kan sannsynligvis bli brukt for deteksjon av andre beslektede protein mål, også i andre organer og arter enn her er presentert.
Introduction
Til tross for utnyttelse av avanserte high-throughput analyser utført på methylome, transkriptomet eller proteom- nivå, farging fortsatt gullstandarden for protein deteksjon direkte i vevsprøve, cellekultur eller en celle smøre. Kunnskap om lokalisering / fordelingsmønster, kan immunhistokjemi (IHC) vurdere relative forholdstall og topografiske sammenhengene av target proteiner, og selv indikere deres biologiske aktiviteter. Derfor er IHC mye benyttet for klinisk og forskningsformål, for eksempel, for diagnose, behandling evalueringer, studier av sykdomsmekanismer, funksjonelle og fenotypiske endringer i dyremodeller etc.
I hovedsak omfatter histologi, patologi, biokjemi og immunologi, og IHC betydelig avansert siden 1941, da fluorescensmerkede antistoffer ble benyttet for første gang for å identifisere pneumokokk antigener i infisert vev 1. Visualization av mobilprodukter og komponenter av IHC er basert på binding av antistoffer (ABS) til deres spesifikke antigen (Ag). Dessuten bruker fluoroforen tagget antistoffer, kan immunreaksjoner også visualiseres ved hjelp av enzymer som peroxidase 2,3 eller alkalisk fosfatase 4. Videre er kolloidale gull-merket antistoff 5 som brukes for påvisning av antigen-antistoff-interaksjonen av både lys- og elektronmikroskopi, mens radioaktive markører blir visualisert ved autoradiografi.
Den Ag-Ab-immunoreaksjonsprodukt kan påvises via direkte og indirekte metoder. Den direkte metoden er egentlig raskere og enklere, som den bruker direkte merket primære Abs 6. Men på grunn av betydelig mangel på sensitivitet, blir indirekte metoder å foretrekke til de direkte seg. To-trinns indirekte test prosedyrer krever umerket primær Abs, som den første, og merkede sekundære Abs rettet mot den primære Abs, som det andre lag 7.Signalforsterkning kan oppnås ved å involvere ytterligere, enzym-koblet tertiær Ab (tre-trinns indirekte metode) som binder seg til den sekundære Ab. Vanlig brukte indirekte gjenkjenning metoder er avidin-biotin og peroksidase-antiperoxidase (PAP). Alternativt kan alkalisk fosfatase-antialkaline fosfatase (APAAP) kompleks brukes i stedet for PAP-metoden. Spesielt, alkalisk fosfatase (AP) metoder ser ut til å bli enda mer følsomme enn immunoperoxidase metoder 4. Avidin-biotin kompleks (ABC) en metode som bruker biotinylert sekundært Ab i kombinasjon med enten merket avidin-biotin kompleks (LAB), eller streptavidin-biotin kompleks (plate). Følsomhet kan økes ytterligere ved å involvere avidin merket med peroksidase eller alkalisk fosfatase 8. Andre deteksjonsmetoder i bruk er polymere merking, tyramin forsterkning og immun-rullende sirkel 9. Spesielt, kan forskjellige deteksjonsmetoder kombineres for flere Ag deteksjon i samme vevPrøven som ble rapportert for første gang i 1978 4. Samtidig dobbelt immunofarging presentert her ble utført i formalinfiksert, parafin-innleiret rotte CNS og LN vevssnitt ved hjelp av peroksydase-bundet og AP-konjugerte sekundære antistoffer, henholdsvis. Signalene ble visualisert ved hjelp av 3,3'-diaminobencidine (DAB) kromogen og Fast Blå (FB) APAAP kompleks, henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
etisk Statement
Denne studien er utført i samsvar med retningslinjer fra det svenske National Board for forsøksdyr og EU rådsdirektiv (86/609 / EØF) under de etiske tillatelser N338 / 09, N15 / 10 og N65 / 10, som ble godkjent av nord Stockholm dyreetikk komiteen.
1. Tissue Forberedelse
- Perfusjons & fiksering
- Bedøve dyret med isofluran for å utføre transcardial perfusjon via venstre ventrikkel. Initiere skylling av blodkar med fosfatbufret saltvann (PBS) for å fjerne de blodkomponenter, etterfulgt av 4% paraformaldehyd i 0,1 M PBS (PFA).
- Fiksere dissekerte hjerne, ryggmarg og perifere LN vev ved å dyppe i PFA. Etter 24 timer ved 4 ° C, overføre vev fra PFA inn i PBS og oppbevares ved 4 ° C inntil videre behandling. Alternativt til kommersielle PBS, oppløse 9 g NaCl i 250 ml S &# 246; Rensen buffer og tilsett 750 ml deionisert vann (dH 2 O); for å fremstille 0,2 M Sørensen-buffer (pH 7,4) oppløses 13,8 g NaH 2PO 4 x 1 H 2 O og 71,2 g Na HPO 2 4 x 2 H 2 O i 2,5 l dH 2 O.
- Dehydrering og innebygging
- Kutt vevet inn i ca 5 mm tykke deler ved hjelp av et barberblad.
- Initiere vevet herdeprosessen (dehydratisering) ved hjelp av Tissue-Tek VIP vakuum Infiltrasjon prosessor (standard prosedyre basert på neddykking i stigende konsentrasjoner av etanol, etterfulgt av xylen og endelig parafin (tabell 1).
- Plasser vev i en form og helle i den flytende paraffin rundt prøven for å danne en "parafin blokk". Langtidslagring krever romtemperatur (RT). Men før seksjonering, er det tilrådelig å kjøle ned blokkene, for eksempel, natten over (o / n) ved 4 ° C.
2. Seksjonering
- Plasser parafin blokken inn i en fast holder av sleden mikrotomen, som kan bevege seg frem og tilbake tvers over kniven. Juster den optimale vinkel mellom blokken og den mikrotomkniv (som er avhengig av kniven geometrien, men også av skjærehastighet og teknikk).
- Skjær 3-5 mikrometer tykke tverrsnitt fra parafinblokken.
- Overfør bare kuttet seksjon i en vannbeholder og montere den senere fra vannet på glasset lysbildet.
- Trykk den monterte delen forsiktig mot et papirhåndkle for å fjerne rester av vann og mulige luftbobler. Kommersielt pre-belagte selvklebende glass er tilrådelig.
- Tørr monterte lysbilder for et par timer i en ovn på 50 - 60 ° C.
3. Deparaffinization (Utvanning & Blokkering den endogene Peroxidase)
- Fordype lysbildene 2x i xylen (alternativt xylen erstatningXem-200), hver gang 15-20 '.
- Skyll i 99% etanol.
- For å blokkere endogen peroksidase-aktivitet, inkuber seksjoner for 30 'i metanoloppløsning inneholdende 0,25% hydrogenperoksid.
- Fortsett rehydrering ved anvendelse av etanol med økende vanninnhold (99%, 70%, ender opp i destillert vann.
- Fra dette punktet til montering av dekkglass seksjoner må holdes fuktig.
4. Antigen Retrieval
- Bruk en mat damper for koking lysbildene i et antigen gjenfinning oppløsning (i dette tilfellet EDTA pH 8,5-buffer) for 60 '(EDTA-buffer stamoppløsning inneholder 1,21 g Tris og 0,37 g EDTA ble oppløst i 50 ml dH 2 O, for å fremstille arbeids oppløsning fortynnet 2,5 ml EDTA-forrådsoppløsning i 47,5 ml dH 2 O).
- Kjøl ned lysbildene på RT for ca. 1 time og deretter skylle 3 - 5 ganger med Tris-bufret saltoppløsning (TBS, bruk alternativt PBS) bestående av 0,05 M tris og 0,15 M NaCl; pH 7,5 justert with HCl. Alternativt kan du bruke kommersielle TBS.
5. Blokkering de uspesifikke bindingssteder
- For å unngå uspesifikk bakgrunnsreaksjoner, inkuber avsnittene om RT i 30 minutter i blokkeringsløsning inneholdende 10% føtalt kalveserum (FCS) og 90% DAKO buffer.
6. Dobbelt Immunolabeling: Samtidig Inkubasjon med Primær-Abs
- Fortynn nødvendige mengde av primære antistoffer i blokkeringsløsning og inkuber o / n ved 4 ° C. For den doble farging kombinere α-eotaxin (Ccl11, 1: 300) med α-Cd68 (ED1, 1: 1000) eller α-Iba1 (Aif1, 1: 1000) eller α-CD8a (Ox-8, 1: 200) .
- Skyll lysbilder søke disse 3-5 ganger med TBS buffer (bruk alternativt 10x fortynnet DAKO buffer).
- Fortynn nødvendige mengden av sekundære antistoffer (biotinylert anti-geit og AP-konjugert anti-mus, både 1: 200) i blokkeringsløsning og inkuber i 1 time på RT.
- Skyll lysbildene 3 - 5x med TBS buffer (osse alternativt 10x fortynnet DAKO buffer).
- Inkuber objektglassene med avidin-pepperrot peroksydase kompleks (HRP) fortynnet i blokkeringsløsning i 1 time på RT.
- Skyll lysbildene 3 - 5 ganger med TBS buffer (bruk alternativt 10x fortynnet DAKO buffer).
7. Visualisering
- Visualisering av det bundne AP-merket sekundært antistoff
- Fremstille 0,1 M Tris-HCl-buffer ved å oppløse 12,1 g tris i en L dH 2 O og justere pH til ved hjelp av HCl. Bruk samme Tris-HCl-buffer for å fremstille en M levamisol oppløsning. Forbered fersk 4% Nano 2 løsning i dH 2 O.
- For å oppnå 50 ml av Fast blå (FB) substrat (volum som kreves for en standard glass kyvette) oppløse 6,25 mg naftol-AS-MX-fosfat i 312,5 pl DMF i glassrøret og omrør i 50 ml forvarmet (37 ° C) Tris-HCl-buffer. For å oppløse 12,5 mg FB RR Salt i 312,5 mL 2 N HCl legge 312,5 mL av tidligere behandling anleggrød 4% NaNO2-oppløsning og blandingen rørt inn i den samme 50 ml forvarmet Tris-HCl-buffer. Rist lett inntil den gule væsken blir klar og endelig legge 77 mL av tidligere utarbeidet en M levamisol løsning. Filtratet oppnådde blandingen og hell oppå lysbilder som er lagt inn i glasset kyvette.
- Initiere inkubering ved 37 ° C og styre utvikling av fremgangsmåten under lysmikroskop ca. hver 15-30 min. Hvis du slår fuzzy, erstatte FB løsningen med frisk blanding.
- Skyll lysbildene 3 - 5x med TBS buffer og overføring senere i PBS buffer.
- Visualisering av det bundne biotinylerte sekundære antistoffet
- Forbered DAB / H 2 O 2 utviklende oppløsning ved fortynning av 1 ml DAB-stamoppløsning (25 mg DAB per 1 ml PBS) i 49 ml PBS. Legg 16,5 ul H2O 2 og filtratet før helling på seksjonene.
- Konvertering av kromogen DAB inn utløsende pannen pigment kan være umiddelbar. Styrer det fremkallende prosess under lysmikroskop (selv par sekunder lengre inkubasjon kan ta opp en høy bakgrunn og maskere den spesifikke signal).
- Intensiteten av brunt pigment utfellingen kan alternativt forbedres ved inkubering i oppløsning bestående av 2% kobbersulfat og 0,9% NaCl for 5 '.
- Skyll lysbildene 3 - 5 ganger med PBS og til slutt med dH 2 O, bruker alternativt vann fra springen.
- Monter skinnene med dekkglass direkte fra vannet ved hjelp vandig GelTol monteringsmedium. Unngå å skape luftbobler.
- Tillate fullstendig tørking av monteringsmedium, f.eks, o / n ved 4 ° C. Oppbevar tørket lysbilder på RT.
| 1. | % etanol | 20 ' | 40 ° C |
| 2. | % etanol | 60 &# 39; | 40 ° C |
| 3. | % etanol | 90 ' | 40 ° C |
| 4. | % etanol | 60 ' | 40 ° C |
| 5. | % etanol | 90 ' | 40 ° C |
| 6. | % etanol | 60 ' | 40 ° C |
| 7. | % etanol | 90 ' | 40 ° C |
| 8. | % etanol | 120 ' | 40 ° C |
| 9. | xylol | 30 ' | 40 ° C |
| 10. | xylol | 60 ' | 40 ° C |
| 11. | parafin | 60 ' | 60 ° C |
| 12. | parafin | 60 ' | 60 ° C |
| 13. | parafin | 60 ' | 60 ° C |
| 14. | parafin | 120 ' | 60 ° C |
Tabell 1. Tissue Processing av Tissue-Tek VIP Vacuum infiltrasjon prosessor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Doble immunostainings (co-stainings) ble utført i formalinfiksert, parafininnebygd rotte CNS og LN seksjoner. 3-5 mikrometer tykke vevssnitt ble kuttet ved hjelp av en slede mikrotom, montert senere på pre-belagt selvklebende glass og behandlet som tidligere beskrevet 10,11,12. I korthet, etter deparaffinizing, vev rehydratisering og endogen peroksidase inaktivering, ble seksjoner kastet antigenet gjenfinningsprosess, etterfulgt av et blokkeringstrinn for å eliminere uspesifikke bindingsseter. De co-stainings ble utført i følgende kombinasjoner: i) Ccl11 / Iba-1, ii) Ccl11 / ED1 og iii) Ccl11 / CD8. Den primære Abs brukes for hver co-farging ble reist i to forskjellige arter (geit og mus, henholdsvis), som gjorde sin samtidig inkubasjon. Ccl11 ble visualisert ved den brune peroksidase reaksjonsproduktet, mens Iba-1, ED1 og CD8, ble visualisert ved den blå AP-signalet.
10. I henhold til IHC analyser foretatt på rotte CNS, Ccl11 var til stede i pericarya, dendritter og aksoner av neuronene som ligger i de ventrale horn av ryggmargen grå materie (figur 1A og B). Videre enkelt Ccl11 + plasmaceller var påvisbare i de samme vev seksjoner (figur 1 A), så vel som enkelt Ccl11 + / ED1 + makrofager og hjernehørende mikroglia observert ved betennelse området (data ikke vist, ED1 er en markør for lysosomale proteiner i aktiverte makrofager og mikroglia 13). Spesielt Ccl11 chemokine ble ikke funnet co-lokalisering med Iba-1 + makrofager og hjerne bosatt microglia (1A, Iba-1 er en markør for påvisning av ionisert Ca 2+ -bindi ng protein 14).
IHC-baserte protein målretting utført i det perifere rotte LN utstilt Ccl11 protein samlokalisering med ED1 (figur 2B). Imidlertid finnes det ikke noen Ccl11-sekresjon CD8 + T-lymfocytter var påvisbare i de samme vev seksjoner (figur 2A; CD8 + celler ble påvist ved å bruke anti-CD8a, men da for hovedsakelig cytotoksiske T-celler som bindes til MHC klasse I molekyler 15). Med unntak av utelatelse av primære Abs under o / n inkubasjon i blokkeringsoppløsningen, ble kontrollseksjoner behandlet som beskrevet i protokollen. Ingen deteksjons signaler om målet proteiner (som presenteres i figur 1A, B og 2A, B) ble observert i CNS og LN kontrollseksjoner (figur 1C og 2C, henholdsvis).
s / ftp_upload / 50425 / 50425fig1.jpg "/>
Figur 1. A, B: Double Farging i Rat LN. Primære antistoffer rettet mot Ccl11 kjemokin i kombinasjon med enten α-CD8 (A) eller ED1 (B). Ingen co-lokalisering innenfor den samme cellen ble observert for Ccl11 + (brunt) og CD8 + -celler (blå) B:. Ccl11 deteksjonssignal (brun) ko-lokaliser med markør for en lysosomal protein i makrofager (ED1, blå). C: Negativ kontroll; en detalj som viser umerkede bosatt celler i det perifere LN. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. A, B: Double Farging i Rat SPinal Cord. Ventral horn av grå materie stiller Ccl11 i nerve pericarya, dendritter og aksoner (brun) co-farget med enten Iba-1 + (A, blå) eller ED1 + (B; blå) makrofager / microglia celler. C: Negativ kontroll; en detalj som viser umerkede bosatt celler i ventral horn av ryggmargen grå materie. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Standard IHC prosedyrer ofte krever spesielle tilpasninger for å få et optimalt resultat, som ofte innebærer omfattende erfaring, men også "prøving og feiling" tilnærming. Fra vev fremstilling inntil målet for visualisering, kan nesten hvert trinn i protokollen underkastes individuelt utformet modifikasjoner for å forbedre det endelige utfall. Double flekker protokoll som presenteres her eksemplifiserer IHC-baserte protein targeting spesielt justert for å vurdere sammenhengene mellom målet proteiner av vår interesse i formalinfiksert, parafininnebygd rotte CNS og LN vevssnitt berørt av nevroinflammasjon. Som sådan, kan den brukes som en tutorial for å lære teknikken av IHC, men også som en kilde til inspirasjon for mer avanserte studier. Det bør imidlertid være oppmerksom på at en ren gjengivelse av denne protokollen for målretting andre proteiner og / eller i andre vev enn her presenteres kan generere suboptimale resultater.
In situ hybridisering hjelp låst nukleinsyre (LNA) riboprobe mot Ccl11 utstilt oppregulering av de respektive mRNA nivåer i CNS av congenic rotte belastning 10. Dette funnet ble bekreftet av qPCR analyser. Videre qPCR avslørte Ccl11 oppregulering også i congenic perifere LN sammenlignet med villtype (wt) stamme. Til slutt, Western Blot (WB) viste signifikant oppregulering av Ccl11 protein i begge målet vev av sykdommen beskyttet congenic rotte belastning 10. Derfor ønsket vi å undersøke opprinnelsen til denne chemokin direkte i målet vev, og for det formålet vi utviklet her beskrevet dobbel farging protokollen.
Foruten å unngå mekanisk skade av vevet under post-mortem disseksjon og post-fiksering avkalking, kan vev seksjonering virker ganske utfordrende. Snitte krever vanligvis dyktighet og praksis. Kvaliteten på skive er avhengig av mange aspekter sUCH som justerer en rett vinkel mellom vev blokken og kniven for å redusere det trykk som utøves på prøven under skjæring, kan skjærehastighet, etc. Tykkelsen av parafininnstøpte vevssnitt produsert av sleden mikrotom varierer fra 2 til 50 um. Skjær parafin vevssnitt er montert fra et varmt vannbad på glassplater fortrinnsvis kommersielt belagt med et klebemiddel slik som poly-L-lysin eller aminopropyltrietoksysilan (APTS) for å sikre et bedre hold under krevende fargeprosedyre. I motsetning til Cryo vevssnittene som skjæres ved omtrent -20 ° C ved anvendelse av cryomicrotome og tørket ved RT før fargingen, avkjølt parafinblokker blir oppskåret ved RT, og deretter tørket ved 50- 60 ° C før deparaffinization.
Meget bevarte vev arkitektur, celle morfologi og målet epitoper er avgjørende for å vurdere lokalisering og forholdet mellom målet proteiner. For å oppnå optimal vev preservasjon, prøver å være skikkelig fast, enten ved hjelp av koagulerende eller tverrbindings fiksativ. Koagulerende fiksativ, slik som etanol, er oftere brukt for nedfrysing. Proteindenaturering under anvendelse av etanol oppnås gjennom vev dehydrering 9; som kan resultere i utilstrekkelig cellulær bevaring 16. I motsetning til koagulere fiksativer, er formaldehyd en tverrbindingsfikseringsmiddel som blir mest brukt i rutinen histologi og IHC 9 for både cryo- og parafin vev bevaring. Vi har oppnådd en optimal fiksering for rotte CNS og LN ved å dyppe i formaldehyd løsning i 24 timer ved 4 ° C før avkalking og påfølgende parafin innebygging. Til tross for å forårsake dyptgående endringer i konformasjonen av makromolekyler (formaldehyd nemlig danner metylenbroer som fornettes proteiner og dermed maskere antigener, som kan hindre spesifikk binding av antistoffer), denne semi-reversibel kovalent reagens gir høy kvalligheten vev bevaring. Spesielt, kan temperatur og varighet av fiksering med tverrbindingsmidler påvirke flere aspekter av IHC som snitting, epitop deteksjon og til og med kryss-reaktivitet. Dermed både under-fiksering og over-fiksering ved hjelp av aldehyd-baserte reagenser som formaldehyd kan føre til gjenstander som er hovedsakelig på grunn av autolyse eller overdreven kryssbindinger 17, henholdsvis. Likevel kan en uspesifikk bakgrunnsfarging på grunn av hydrofobe proteinbinding observert ved overfixation bli redusert ved bruk av lave saltet buffere inneholdende ikke-ioniske vaskemidler, eller ved å heve pH i fortynningsbuffer ved bruk av polyklonale Abs 18. Imidlertid kan en uspesifikk bakgrunnsfarging (støy) forårsaket av ioniske og elektrostatiske protein interaksjoner bli redusert ved hjelp av fortynningsmiddel buffere med høy ionestyrke, som samtidig kan forverre den støy forårsaket av hydrofob proteinbinding 18. Når det gjelder påvisning av mål-epitoper, formaldehyd-induced endring av den tertiære struktur av proteiner som kan være, men ikke helt, reverseres av antigen gjenfinning 19: i) ved oppvarming i buffere med forskjellige pH-verdier (varmeindusert epitop gjenfinning (HIER), ii) ved enzymatisk nedbrytning (protease-indusert epitop gjenfinning (PIER; 20)), iii) ved inkubering i sterk alkalisk eller sur oppløsning, eller sukrose 21, 22 eller iiii) ved behandling med konsentrert maursyre 23. HIER vises praktisk for flertallet av målet epitoper 19. I tillegg til oppvarming varighet, kan pH-verdien av oppløsningene slik som EDTA (pH 5,5, 8,5 eller 9,0) eller natrium-citrat-buffer (pH 6.0- 6.2) være avgjørende for utfallet av HIER. Spesielt ble den mest tilfredsstillende resultat i vårt studium oppnås ved å dampe prøvene i 1 time i EDTA-løsning med pH-verdi 8,5.
Selv om antistoffer fortrinnsvis binde seg til deres spesifikke epitoper, tiltrekning til uspesifikke, lik den beslektet Ag bindendenettsteder, ikke kan utelukkes helt. Spesielt, sannsynligvis den mest effektive metode for å redusere bakgrunnsfarging er inkubasjon i blokkerings proteiner (for eksempel FCS anvendt i vårt studium) før påføring av primær Abs 9. Monoklonale primære Abs er hvertfall foretrukket over polyklonale Abs skyldes høyere spesifisitet og dermed redusert uspesifikk bakgrunnssignal. Ikke desto mindre kryssreaktivitet fremdeles kan virke, som monoklonale Abs er rettet mot epitoper som vanligvis består av et lite antall aminosyrer, som kan være en del av et annet (uspesifikk) protein 24. I motsetning til monoklonale, polyklonale Abs ha en høyere sjanse for å gjenkjenne flere isoformer av målet protein. Vi opprinnelig brukt to forskjellige primære Abs å oppdage Ccl11: i) en polyklonale oppvokst i geit og ii) et monoklonalt oppvokst i mus. I våre hender, begge produktene utstilt samme fargemønster for målet chemokine. For å utføre samtidig co-farging, brukte vi geit-anti rotte Ccl11 Ab i kombinasjon med antistoffene mot Iba-1, ED1 og CD8, henholdsvis, som alle ble produsert i mus. Ikke desto mindre, i tillegg samtidig, dobbel farging kan også utføres sekvensielt 25, som er nødvendig for ko-merking av det primære Abs produsert i de samme artene.
Den optimale arbeids konsentrasjonen av Abs anvendt i vårt studium ble beregnet ved hjelp av test-fortynningsserie som et optimalt forhold mellom intensiteten av spesifikt signal og bakgrunnsstøy. Det bør imidlertid være oppmerksom på at en optimal arbeids konsentrasjon av det samme antistoff kan enkelte ganger variere mellom organene, arter, bakgrunn patologi, etc. Spesielt, ble permeabiliseringen ikke er nødvendige i vårt fargeprosedyre utført i parafin innebygd, 3-5 um tykke vevssnitt imidlertid vaskemidler som Triton X-100 kan fortsatt ha vært brukt til å redusere overflatespenningen og således å lette binding mellom antigen og antistoff. PåTvert imot, permeabilization- mediert forbedring av Ab penetrasjon er ofte nødvendig for protein deteksjon i dyrkede celler eller cellesuspensjoner (immunocytochemistry (ICC)), for immunfluorescens (IF) i kryo seksjoner og IHC / IF i fersk (tykk, vibratome snitt) fritt flytende vevssnitt.
Flere kontroller er essensielt viktig for å generere spesifikke / pålitelig immunotargeting. Som en positiv kontroll, brukte vi lunger fra en rottemodell for astma, der vi kunne oppdage Ccl11 + eosinofiler. De negative kontroller ble inkubert bare i blokkeringsoppløsningen o / n ved 4 ° C i fravær av det primære Abs.
Vi har allerede nevnt noen årsaker og mulige løsninger for reduksjon av en bakgrunnssignal. En uspesifikk farging produktet kan også forekomme som reaksjon mellom DAB og pseudoperoksydase av de røde blodcellene og peroksydase av de myeloide celler 26. Aktiviteten til disse enzymene, akkurat som støy caused av endogent biotin eller AP allerede er blitt redusert i løpet av formalinfiksering. Imidlertid er nødvendig for deres videre, eller fullstendig inaktivering 27, 28. Bakgrunnsfarging forårsaket av AP-aktivitet i pattedyr-vev, kan ytterligere hindres ved levamisole 29, eller av eddiksyre 29 forbehandlingen med metanol / H 2 O 2. Uspesifikk binding som et resultat av ionisk tiltrekning mellom avidin og motsatt ladede cellulære molekyler 30 kan unngås ved å erstatte avidin fra eggehvite med streptavidin fra Streptomyces avidinii 31.
DAB er trolig den mest brukte kromogen i IHC. I tillegg til DAB (brunt reaksjonsprodukt), andre peroxidase kromogener i bruk er 3-amino-9-etylkarbazol (AEC, red), 4-klor-1-naftol (CN, blå) og tetrametylbenzidin (TMB, blå). Vanligvis velges AP kromogener er FB, Fast Red (FR), ny fuksin og 5-brom-4-klor-3-indolylphosphate / nitro blue tetrazoliumklorid (BCIP / NBT). Valget av enzymer og kromogener er i utgangspunktet et spørsmål om individuell preferanse, men den kan være styrt av målet funksjoner som lokalisering, uttrykksmønster, men også av tilstedeværelse av endogene pigmenter (melanin, hemosiderin) 32. Counterstain er den siste, fakultative trinn i IHC fremgangsmåte vanligvis utført ved anvendelse av hematoksylin, kjerne rask rød eller grønn metyl 18. Generelt mer egnet for enkelt merking, letter counterstain tolkningen av vev morfologi og det bør være diskret utvikles for å unngå enhver interferens med kromogen bunnfall.
Ved gjennomføring av de fargeprosedyre vevssnittene bør nøye monteres med et dekkglass ved hjelp av et monteringsmedium. Dannelse av luftbobler bør unngås. Foruten fysisk beskyttelse, monteringsmedium bedrer visualisering og kvaliteten på bildebehandling. Enten organisk / hydrofob eller vandig / hydrofile, den lmoice av monteringsmedium er avhengig av løseligheten av sluttproduktet i det organiske oppløsningsmiddel. Mens en toluen- basert monteringsmedium ville være egnet, for eksempel for DAB, kan vandige monteringsmedium brukes på alle enzymatiske kromogener, inkludert fluorescens-merking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) | Baxter | 1001936060 | Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment. |
| Sodiumchloride (NaCl) | Merck | 1.0604 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% in 1x PBS | Apl pharma | 34 24 28 | Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity. |
| Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) | Sigma-Aldrich | 459844-1L | Flamable. |
| Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 | Sigma-Aldrich | 534056 | Flamable. Acute toxicity. |
| Histo-Comp Paraffin Wax | Tissue-Tek | V0-5-1001 | |
| Adhesive Microscope Slides | Starfrost | MIC-1040-W | |
| Xylol substitute XEM-200 | Vogel GmbH | ND-HS-200 | Respiratory sensitization. Carcinogenicity. |
| α-CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA48G | |
| α-Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody | Millipore | MABN92 | |
| α-CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA341R | |
| α-eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody | Santa Cruz BT | SC-6181 | |
| Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody | Dakopatts, Denmark | D0314 | |
| Biotinylated secondary antibody | Amersham Biotech | RPN1025 | |
| Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) | Sigma-Aldrich | A3151 | |
| Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) | Sigma-Aldrich | N4875-1G | Acute toxicity. |
| Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) | Sigma-Aldrich | FBS25 | |
| Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) | Sigma-Aldrich | 31742 | Acute toxicity. |
| 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) | DAKO | S3000 | Highly flammable. Toxic. |
| Copper sulphate (CuSO4) | Merck | 1.02791 | Acute toxicity. Environmental hazzard. |
| GelTol Aqueous Mounting Medium | Thermo Electron Corporation | 230100 | |
| Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) | Merck | 107210 | Acute toxicity. |
| Methanol (CH3OH) | Fluka | 65543 | Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable. |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) | AppliChem | A1379 | Skin and eye irritation. |
| Tris Buffered Saline (TBS), tablet | Sigma-Aldrich | T5030 | |
| Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) | Merck | 1.0658 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) | Merck | 1.06346 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Cambrex BioScience | DE-14-802F | |
| DAKO cytomation wash buffer 10x | DAKO | S3006 | Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming. |
| N,N-Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) | Fluka | 40250 | Flammable. Acute toxicity. |
| Glas coverslips 24 x 36 mm | Menzel-Gläser | BB024036A1 | |
| Hydrochloric acid, conc. (HCl) | Sigma-Aldrich | 30721 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Hydrochloric acid solution volumetric, 2 M HCl (2 N) | Fluka | 71826 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) | Sigma-Aldrich | S2252 | Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment. |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) | Merck | 1.08454 | Oral exposures may cause reproductive and developmental effects. |
| Equipment | |||
| Tissue-TekV.I.P Vacuum Infiltration Processor | Sakura | 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz | |
| Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome | Hacker instruments | ||
| Household food steamer | Braun | MultiGourmet FS 20 | |
| Light microscope | Leica Polyvar 2 | ||
References
- Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
- Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).
- Mason, D. Y., Sammons, R. Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use. Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).
- Polak, J. M., Van Noorden, S. Introduction to immunocytochemistry. , Bios Scientific Publishers Ltd. Oxford, UK. (2003).
- Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods. American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).
- Ramos-Vara, J. A.
- Adzemovic, M. Z., et al. Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats. PloS one. 7, 39794 (2012).
- Bauer, J., et al. Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes. Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).
- Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord. The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).
- Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).
- Hirasawa, T., et al. Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice. Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).
- Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules. Nature. 336, 79-81 (1988).
- Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).
- Hayat, M. Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy. , Kluwer Academic. New York. (2002).
- Boenisch, T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).
- Huang, S. N. Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).
- Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).
- Taylor, C. R., Shi, S. R. Antigen retrieval: call for a return to first principles. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).
- Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).
- Nelson, P. N., et al.
- Van der Loos, C. Immunoenzyme multiple staining methods. , Bios Scientifc publishers Ltd. New York. (1999).
- Elias, J. Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis. , ASCP Press. Chicago. (2003).
- Straus, W. Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).
- Streefkerk, J. G. Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).
- Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).
- Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones. Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).
- Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells. The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
