Abstract
免疫組織化学（IHC）は、高度に、特定の信頼性と魅力的なタンパク質の可視化を提供します。 IHCベースの多色標識の正しい性能および解釈は、中枢神経系（CNS）のような高脂肪含有量を有する組織中の標的タンパク質との間の相互関係を評価するために利用される場合は特に、困難です。
我々のプロトコルは、特にラットCNSおよび神経炎症によって影響末梢リンパ節（LN）の両方の構造および可溶性タンパク質の検出のために調整し、標準的な免疫標識技術の改良を表します。それにもかかわらず、さらなる改変の有無にかかわらず、我々のプロトコルはそうであってもここで紹介する以外の臓器や種で、他の関連するタンパク質標的の検出のために使用することができます。
Introduction
高度なハイスループットの使用にもかかわらずmethylome、トランスクリプトームまたはプロテオームさえレベルで実行解析、免疫染色は、組織試料、細胞培養物又は細胞塗抹標本に直接タンパク質検出のための黄金の標準のままです。局在/分布パターンを明らかにすることによって、免疫組織化学（IHC）は、相対比と標的タンパク質の地形的相互関係を評価し、さらにそれらの生物学的活性を示すことができます。したがって、IHCは広く、診断、治療の評価のために、 例えば 、臨床研究のためなど病気のメカニズム、動物モデルにおける機能と表現型の変化の研究を利用しています
基本的に組織学、病理学、生化学および免疫を備え、IHCが大幅に蛍光標識した抗体は感染組織1に肺炎球菌抗原を同定するために初めて使用された1941年以来進めてきました。 VIHCによる細胞製品およびコンポーネントのisualizationは、その特定の抗原（Ag）からに対する抗体（ABS）の結合に基づいています。フルオロフォアタグ付けされた抗体を使用するほかに、免疫反応はまた、ペルオキシダーゼ2,3またはアルカリホスファターゼ4のような酵素を使用して可視化することができます。放射性標識は、オートラジオグラフィーによって可視化しながら、さらに、金コロイドタグ抗体5は 、光と電子顕微鏡の両方により特異的な抗原-抗体相互作用を検出するために使用されます。
Agを抗体の免疫反応は、直接的および間接的な方法によって検出することができます。それは直接標識一次Absの6を使用していますように直接的な方法は、より速く、より簡単な本質的です。しかし、感度の大幅な不足のためには、間接的な方法は、直接のものに好適です。二段階の間接検出手順は、最初のように、非標識一次腹筋を必要とし、第二層7として、主要な腹筋に対して向けられた二腹筋標識。信号増幅は、さらに二次抗体に結合する酵素 - 結合された第三抗体（三段間接法）を含むことによって達成することができます。一般的に使用される間接的な検出方法は、アビジン - ビオチンペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ（PAP）です。あるいは、アルカリホスファターゼantialkalineホスファターゼ（APAAP）複合体ではなく、PAP法を用いることができます。特に、アルカリホスファターゼ（AP）メソッドは、免疫ペルオキシダーゼ法4よりもさらに敏感であるように思われます。アビジン - ビオチン複合体（ABC）法は、標識アビジン - ビオチン複合体（LAB）のいずれかとの組み合わせで、ビオチン化二次抗体を使用し、またはストレプトアビジン - ビオチン複合体（SLAB）標識しました。検出感度はさらにペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ8で標識したアビジンを含むことによって増大させることができます。使用中の他の検出方法は、ポリマー標識、チラミン増幅および免疫ローリングサークル9です。特に、別の検出方法は、同じ組織内の複数のAgの検出のために組み合わせることができここに提示1978年4。同時二重免疫染色で初めて報告されたサンプルは、それぞれ、ペルオキシダーゼ結合し、AP結合二次抗体を用いて、ホルマリン固定、パラフィン包埋されたラットCNSおよびLN組織切片で行いました。信号は、それぞれ、3,3'- diaminobencidine（DAB）色素原とファーストブルー（FB）APAAP複合体を用いて可視化しました。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
倫理的なステートメント
本研究は、N15 / 10とによって承認されたN65 / 10、、倫理的な許可N338 / 09下の実験動物のためのスウェーデン国家委員会と欧州共同体理事会指令（609分の86 / EEC）のガイドラインに従って行われます北ストックホルムの動物倫理委員会。
1.組織標本
- 灌流＆固定
- 左心室を介しtranscardial灌流を行うためにイソフルランで動物を麻酔。 0.1 M PBS（PFA）中の4％パラホルムアルデヒドに続く血液成分を除去するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて血管系のリンスを開始します。
- PFAに浸漬することにより、解剖脳、脊髄及び末梢LN組織を固定します。 4℃で24時間後、さらに処理するまで4℃でPBSにPFAから組織や店舗を転送します。あるいは、商業PBSに、250ミリリットルS＆で9グラムのNaClを溶解＃246; rensenバッファと750ミリリットルを脱イオン水（のdH 2 O）を追加します。 0.2 Mソレンセン緩衝液（pH7.4）を調製することは2.5 L の dH 2 O中に13.8グラムのNaH 2 PO 4×1H 2 Oおよび71.2グラムのNa 2 HPOのx 2H 4 2 Oに溶解します
- 脱水＆埋め込みます
- カミソリの刃を使用して、約5ミリメートルの厚さの部分に組織を切断します。
- キシレン、最後にパラフィン（ 表1）、続いて組織テックVIP真空浸潤プロセッサ（エタノールの上昇濃度に浸漬に基づく標準的な手順を使用して、組織の硬化処理（脱水）を開始します。
- 金型内に組織を置き、「パラフィンブロック」を形成するために、試料周辺の流動パラフィン中に注ぎます。長期保存は、室温（RT）が必要です。しかし、セクショニングの前に、 例えば 、ブロックを冷却するために4℃で（O / N）で一晩推奨されます。
2.セクショニング
- ナイフを横切って前後に移動することができる、スレッジミクロトームの固定ホルダーにパラフィンブロックを配置します。ブロックとミクロトームナイフ（すなわち、ナイフの幾何学的形状に依存するだけでなく、切削速度および技術上の）間の最適な角度を調整します。
- パラフィンブロックから5μm厚断面 - 3をカット。
- 水容器の中にだけ切断した断面を転送し、スライドガラス上に水から、その後、それをマウントします。
- 残留水および潜在的な気泡を除去するためにペーパータオルに対して慎重に取り付けられた部分を押してください。商業的にプレコーティングされた接着剤ガラススライドをお勧めしますが。
- 60°C - ドライは50にストーブに時間のカップルのためのスライドをマウントしました。
3.脱パラフィン（再水和＆内因性ペルオキシダーゼブロッキング）
- スライドを浸し2倍キシレン（あるいはキシレン代替品へXEM-200）、毎回15から20」。
- 99％エタノールですすいでください。
- 内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックするために、0.25％過酸化水素を含むメタノール溶液に30 'のためのセクションをインキュベートします。
- 蒸留水で終わる、増加水分含量（99％、70％エタノールを使用して再水和を継続します。
- この点からカバーの装着までのセクションでは、湿った保たする必要がスリップ。
4.抗原回復
- （EDTA緩衝原液は、1.21グラムトリスおよび50ミリリットルのdH 2 Oに溶解した0.37グラムのEDTAが含まれている60のための抗原回復溶液（この場合はEDTA pH8.5の緩衝液）」のスライドを沸騰するための蒸し器を使用してください。作業を準備します47.5ミリリットルのdH 2 O中での溶液希薄2.5ミリリットルのEDTA原液）。
- 約室温でのスライドをクールダウン。 1時間してから3すすぎ - トリスで5倍は0.05 Mトリス及び0.15MのNaClからなる（TBSは、代わりにPBSを使用）緩衝生理食塩水; pHを7.5に調整のwi第HClです。あるいは、商業TBSを使用します。
5.非特異的結合部位をブロックします
- 非特異的なバックグラウンド反応を回避するために、10％ウシ胎児血清（FCS）、90％DAKO緩衝液を含有するブロッキング溶液中で30 '室温で切片をインキュベートします。
6.ダブル免疫標識：プライマリ腹筋との同時インキュベーション
- ブロッキング溶液中で一次抗体の必要量を希釈し、O / Nで4℃でインキュベートします。 （; 1 ED1：1,000）α-CD68またはα-IBA1（Aif1、1：1,000）、またはα-CD8α（オックス-8; 1：200）：;二重免疫染色のためにα-エオタキシン（300 1 CCL11）を組み合わせ。
- （代替的に10倍希釈したDAKOバッファを使用）TBSバッファーで3〜5倍のスライドを洗浄します。
- ブロッキング溶液中で、室温で1時間インキュベートする：二次抗体の必要量（200ビオチン化抗ヤギおよびAP結合抗マウス、両方1）を希釈します。
- （私たちをTBS緩衝液で5倍 - スライド3をすすぎEは、代替的に10倍）は、DAKO緩衝液に希釈しました。
- RTでの1時間ブロッキング溶液で希釈したアビジン - 西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（HRP）でスライドをインキュベートします。
- TBS緩衝液で5倍（あるいは10倍希釈DAKOバッファを使用） - スライド3をすすいでください。
7.可視化
- 結合したAP標識二次抗体の可視化
- 1リットルのdH 2 O 12.1グラムのトリスを溶解し、0.1M Tris-HCl緩衝液を調製し、HClを用いによってpHを調整します。 1 Mレバミゾール溶液を調製するために同一のTris-HCl緩衝液を使用します。 dH 2 O中で新鮮に4％のNaNO 2溶液を準備
- ファーストブルー（FB）基板（1標準的なガラスキュベットに必要なボリュームが）ガラス管に312.5μlのDMF中の6.25mgのナフトール-AS-MXリン酸を溶解し、予め温め50mlに攪拌の50ミリリットル（37を取得するには°C）のTris-HCl緩衝液。 312.5μlの2 Nに12.5 mgのFB RR塩を溶解するためにHClが以前prepaの312.5μlを添加します赤の4％のNaNO 2溶液と予め温めトリス-HCl緩衝液の同じ50 mlの中に混合物を攪拌します。黄色の液体が透明になるまで軽く振ると、最終的に先に調製した1 Mレバミゾール溶液を77μlを添加します。ろ液を混合して得られたガラスキュベットに入れスライド上に注ぎます。
- 37℃でのインキュベーションを開始し、約光学顕微鏡下でのプロセスを開発して制御します。すべての15から30分。ファジー回した場合は、新鮮な混合物とFB液を交換してください。
- PBSバッファに続いてTBSバッファーと転送と5倍 - スライド3を洗い流します。
- 結合したビオチン化二次抗体の可視化
- DABは、/ H 2 O 2 49ミリリットルのPBSで1ミリリットルDABストック溶液（1mlのPBSあたり25ミリグラムのDAB）を希釈することにより、現像液を準備します。注ぐ前のセクションに16.5μlのH 2 O 2、ろ液を追加します。
- 眉を沈殿させるに色素原DABの変換n個の顔料は即時にすることができます。 （でも数秒より長いインキュベーションが高いバックグラウンドを上げ、特定の信号をマスクすることができる）、光学顕微鏡下で現像処理を制御します。
- 褐色顔料の沈殿物の強度は、あるいは5 'の2％硫酸銅と、0.9％のNaClからなる溶液中でインキュベートすることによって向上させることができます。
- スライド3をすすぎ- PBSで5倍、最終的にのdH 2 Oで、代わりに水道水を使用しています。
- カバーは、水性GelTolマウンティング培地を使用することにより、水から直接スリップしてスライドをマウントします。気泡を作成しないでください。
- 例えば、O / N、4℃で、封入剤の完全な乾燥を可能にします。ストアは、RT上でスライドを乾燥させました。
| 1。 | ％エタノール | 20 ' | 40°C |
| 2。 | ％エタノール | 60＆＃39; | 40°C |
| 3。 | ％エタノール | 90 ' | 40°C |
| 4。 | ％エタノール | 60 ' | 40°C |
| 5。 | ％エタノール | 90 ' | 40°C |
| 6。 | ％エタノール | 60 ' | 40°C |
| 7。 | ％エタノール | 90 ' | 40°C |
| 8。 | ％エタノール | 120 ' | 40°C |
| 9。 | キシロール | 30 ' | 40°C |
| 10。 | キシロール | 60 ' | 40°C |
| 11。 | パラフィン | 60 ' | 60°C |
| 12。 | パラフィン | 60 ' | 60°C |
| 13。 | パラフィン | 60 ' | 60°C |
| 14。 | パラフィン | 120 ' | 60°C |
組織-Tek社のVIP真空浸透プロセッサによって 表1 組織処理。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
二重免疫染色（共染色）は、ホルマリン固定、パラフィン包埋されたラットCNSおよびLN切片で行いました。 3-5ミクロン厚の組織切片は、スレッジミクロトームを用いて切断し、プレコーティングされた接着剤のガラススライド上にマウントされ、その後、以前10,11,12に記載のように処理しました。簡潔には、組織の再水和および内因性のペルオキシダーゼの不活性化を脱パラフィン後、切片を、非特異的結合部位を除去するブロッキング工程に続いて、抗原回復処理を行いました。 ⅱ）CCL11 / ED1及びiii）CCL11 / CD8、ⅰ）CCL11 /伊庭-1：同時染色は、以下の組み合わせで行いました。各同時染色のために使用される主要なABSが彼らの同時インキュベーションを有効にして2つの異なる種（それぞれ、ヤギ、マウス、）、で育ちました。イバ-1、ED1およびCD8ながらCCL11は、褐色のペルオキシダーゼ反応生成物によって可視化した、青AP信号により可視化しました。
10様多発性硬化症（MS）におけるCCL11ケモカインの役割についての我々の最近の研究では、より大きな文脈に記載されています。 IHCによると、ラットCNSで分析を行った、CCL11はpericarya、樹状突起および脊髄灰白質（ 図1AおよびB）の腹側角に位置する神経細胞の軸索に存在しました。また、単一CCL11 +形質細胞は、同じ組織切片（ 図1A）で検出可能な、ならびに単一CCL11 + / ED1 +マクロファージと炎症部位（データは示さずに観察された脳常駐ミクログリアた。ED1は、リソソームタンパク質のマーカーであります活性化マクロファージおよびミクログリア13）インチ特に、CCL11ケモカインは、伊庭-1 +マクロファージおよび脳常駐ミクログリア（1Aとの共局在化する見つかりませんでした。伊庭-1は、イオン化カルシウムを検出するためのマーカーである2+ -bindi ngのタンパク質14）。
周辺ラットLNで行わ標的とIHCベースのタンパク質は、ED1（ 図2B）とCCL11タンパク質共局在を示しました。しかし、CCL11分泌CD8 + Tリンパ球は、（ 図2A; CD8 +細胞を、抗CD8α、MHCクラスに結合する主細胞傷害性T細胞のマーカーIは、15分子を用いて検出した）同一の組織切片において検出されませんでした。プロトコールに記載のようにブロッキング溶液中でO / Nインキュベーションの間に一次のAbを省略した以外は、制御部は、処理しました。標的タンパク質のない検出信号（ 図1A、B及び2Aに示されるように、B）は、CNSおよびLN制御部（それぞれ図1Cおよび2C）において観察されませんでした。
S / ftp_upload / 50425 / 50425fig1.jpg "/>
図1. A、B：ラットLNにおける二重免疫染色。 α-CD8（A）またはED1（B）のいずれかと組み合わせて、CCL11ケモカインに対して向けられた一次抗体。 。CCL11検出信号（茶色）マクロファージにおけるリソソームタンパク質のマーカー（ED1、青）で共局在化：同一セル内には共局在は、CCL11 +（茶色）およびCD8 +細胞（青）Bのために認められませんでした。 C：ネガティブコントロール;末梢LNで標識されていない常在細胞を示す詳細は、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. A、B：ラットSでの二重免疫染色pinalコード。 。神経pericarya、樹状突起と軸索にCCL11を示す灰白質の前角（ブラウン）伊庭-1 +（;青）のいずれかで共染色またはED1 +（B;青）、マクロファージ/ミクログリア細胞C：ネガティブコントロール;脊髄灰白質の前角で標識されていない常在細胞を示す詳細は、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
標準的なIHC手順は、多くの場合、一般的に豊富な経験だけでなく、「試行錯誤」アプローチを意味し、最適な結果を得るために、具体的な調整を必要とします。組織標本からターゲットの可視化まで、プロトコルのほぼ各ステップを個別に最終的な結果を改善するために修飾を設計するために行ってもよいです。ここで紹介する二重染色プロトコルは、特に神経炎症の影響を受け、ホルマリン固定、パラフィン包埋したラットCNSおよびLN組織切片における私たちの目的の標的タンパク質間の相互関係を評価するための調整ターゲットとIHCベースのタンパク質を例示しています。このように、IHCの技術を学ぶためのチュートリアルとしてだけでなく、より高度な試験のためのインスピレーションの源として使用することができます。しかし、提示され、ここよりも、および/または他の組織中の他のタンパク質を標的とするため、このプロトコルの単なる再生は次善の結果を生成する可能性があることに留意すべきです。
CCL11は、コンジェニックラット系統10のCNSにおけるそれぞれのmRNAレベルのアップレギュレーションを示しに対して> in situハイブリダイゼーションではロックされた核酸（LNA）リボプローブを使用。この知見は、定量PCR分析によって確認しました。さらに、定量PCRは、野生型（WT）株と比較コンジェニック末梢LNにもCCL11のアップレギュレーションを明らかにしました。最後に、ウェスタンブロット（WB）は、疾患保護コンジェニックラット系統10の両方の標的組織におけるCCL11タンパク質の有意な上方制御を示しました。したがって、我々は、標的組織に直接ケモカインの起源を調査することを目的とし、その目的のために、我々は、ここで説明する二重染色プロトコールを開発しました。
死後の解剖と定着後の脱灰中に組織の機械的な損傷を回避することに加えて、組織切片は、かなり挑戦的な表示されることがあります。切片は、通常のスキルと実践が必要です。スライスの品質は多くの側面Sに依存していますUCHは、切断中にサンプルに加えられる圧力を減少させるために組織ブロックとナイフとの間に直角を調整するように、スレッジミクロトームによって産パラフィン包埋組織切片の切削速度、 等厚さは2〜50μmで変化してもよいです。パラフィン組織切片を要求染色手順の間のより良好な保持を確実にするために、好ましくは、商業的に、例えばポリ-L-リジンまたはアミノプロピルトリエトキシシラン（APTS）のように接着剤でコーティングされたガラススライド上に温水浴から搭載されて切断されます。クライオミクロトームを用いて-20℃で約切断し、染色前に室温で乾燥された組織切片をクライオとは対照的に、パラフィンブロックを冷却し、室温でスライスし、続いて脱パラフィン前に50〜60℃で乾燥させます。
高度に保存された組織のアーキテクチャ、細胞形態及び標的エピトープは、標的タンパク質の局在と相関を評価するために不可欠です。最適な組織PRESERを達成するために、vationは、サンプルは、凝固または架橋固定剤のいずれかを使用して、適切に固定されなければなりません。エタノールのような固定剤を、凝固、より頻繁に凍結保存のために使用されます。エタノールを使用して、タンパク質の変性は、組織の脱水9を介して達成されます。不十分な細胞の保存16をもたらし得ます。固定液を凝固とは対照的に、ホルムアルデヒドは、最も頻繁にルーチン組織学およびIHC 9で使用されている架橋固定剤であります 冷凍のパラフィン両方の組織保存のため。私たちは前に脱灰とその後のパラフィン包埋し、4℃で24時間、ホルムアルデヒド溶液に浸漬することによって、ラットCNSおよびLNのための最適な固定を達成しています。巨大分子のコンホメーションに大きな変化を引き起こすにもかかわらず、この半可逆共有結合試薬はQUAL高提供（ホルムアルデヒド、すなわち、タンパク質を架橋し、それによって抗体の特異的結合を防止することができる抗原をマスクするメチレン架橋を形成します）性の組織保存。注目すべきことに、架橋試薬と固定の温度および時間は、セクショニング、エピトープの検出、さらには交差反応としてIHCのいくつかの側面に影響を与えることができます。したがって、両方の固定アンダーとオーバーの固定ホルムアルデヒド等のアルデヒドベースの試薬を使用すると、それぞれ、主に自己分解または過度のクロスリンク17に起因するアーティファクトを引き起こす可能性があります。それにもかかわらず、疎水性タンパク質にoverfixationによって観察された結合による非特異的バックグラウンド染色は、ポリクローナルまたはABS樹脂18を使用する場合、希釈緩衝液のpHを上昇させることによって非イオン性界面活性剤を含有する低塩漬け緩衝液を使用して低減することができます。しかしながら、イオン性及び静電気的タンパク質相互作用に起因する非特異的バックグラウンド染色（ノイズ）同時に18を結合する疎水性タンパク質に起因するノイズを悪化させることができる高イオン強度、希釈剤緩衝液を用いて還元することができます。それは標的エピトープの検出になる、ホルムアルデヒドI完全に、抗原回復19で反転されていないが、タンパク質の三次構造のnduced変化は、することができます：種々のpH値（熱誘導エピトープ回復（HIER）との緩衝液中で加熱することによりⅰ）、ⅱ）酵素分解によって（プロテアーゼによって誘発されます濃ギ酸23で処理することにより強アルカリまたは酸溶液、またはスクロース21、22またはIIII）でのインキュベーションにより）、ⅲ）;エピトープ回復（20 PIER）。 HIERは、標的エピトープ19の大多数のための便利な表示されます。加熱時間の他に、例えば、EDTA（pHを5.5、8.5または9.0）またはクエン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0- 6.2）などの溶液のpH値は、HIERの結果のために不可欠であり得ます。特に、我々の研究の中で最も満足のいく結果は、pH値8.5とEDTA溶液中で1時間サンプルを蒸しすることによって達成されました。
抗体は優先的にその特異的エピトープ、非特異的に魅力に特異的に結合するが、同族のAgと同様に結合しますサイトは、完全に排除することはできません。注目すべきは、おそらくバックグラウンド染色を減少させるための最も効率的な方法は、従来の一次Absの9のアプリケーションに（そのような私たちの研究で用いたFCSなど）のタンパク質をブロックでのインキュベーションです。モノクローナル一次Abは、とにかく、より高い特異性ポリクローナル腹筋よりも優先することにより、非特異的バックグラウンドシグナルを減少させています。モノクローナルAbは、一般的にいくつかの他の（非特異的）タンパク質24の一部であってもよいアミノ酸の数が少ない、からなるエピトープに対して向けられているようにもかかわらず、交差反応性は、まだ、表示される場合があります。モノクローナル抗体とは異なり、ポリクローナルAbは、標的タンパク質の複数のアイソフォームを認識し、より高いチャンスがあります。 ⅰ）ポリクローナルヤギで育っおよびii）モノクローナルがマウスで育った：私たちは、最初にCCL11を検出するために、2つの異なる主要な腹筋を使用していました。私たちの手では、両製品は、ターゲット・ケモカインのための同じ染色パターンを示しました。同時共染色を行うために、我々は、ヤギ抗ラットCCL1を使用しましたすべてのマウスで生産されたそれぞれ伊庭-1、ED1およびCD8に対する抗体、との組み合わせで1抗体。同じ種で産生さ主要Abの同時標識化のために必要なそれにもかかわらず、同時に他に、二重免疫染色はまた、25を順次行うことができます。
我々の研究で使用されるAbの最適な作業用濃度は、特定の信号の強度とバックグラウンドノイズとの間の最適な比率として試験希釈系列によって推定しました。しかし、それは同じ抗体の最適な作用濃度は時々臓器、種、背景病理など注目すべきは、透過性がパラフィン包埋で行われる当社の染色方法において必要とされなかったの間で変化し得ることに留意すべきである、3-5ミクロン厚い組織切片は、しかしながら、トリトンX-100のような界面活性剤は、依然として、表面張力を低減し、従って、抗原と抗体との結合を促進するために使用されてきた可能性があります。オン（IF）逆に、凍結セクションおよびIHC /新鮮な（太い、ビブラトームカット）でIF免疫蛍光のために、抗体の浸透の改善は、一般的に培養した細胞または細胞懸濁液（免疫細胞化学（ICC））にタンパク質検出のために必要とされる媒介permeabilization-自由組織切片をフローティング。
複数のコントロールは、特定/信頼性の免疫標的を生成するための、本質的に重要です。ポジティブコントロールとして、我々はCCL11 +好酸球を検出することができる喘息のラットモデルから肺を使用しました。陰性対照は、一次Abの非存在下でのみ、ブロッキング溶液O中/ N 4℃でインキュベートしました。
我々はすでにバックグラウンドシグナルを減少させるためにいくつかの原因と潜在的な救済を記載しています。非特異的免疫染色製品は、DABと赤血球および骨髄細胞26のペルオキシダーゼのプソイドとの間の反応として生じ得ます。これらの酵素の活性、単にノイズコーなど内因性ビオチンによってエドまたはAPは、すでにホルマリン固定の間に減少しています。しかし、メタノール/ H 2 O 2での前処理は、その更なる又は完全な不活性化27、28のために必要である。哺乳動物の組織中のAP活性に起因するバックグラウンド染色は、さらにレバミゾール29によって、または酢酸29によって阻害され得ます。アビジンと反対に荷電した細胞分子30との間のイオン引力の結果として非特異的結合は、31 avidiniiストレプトミセスからのストレプトアビジンと卵白からアビジンを代入することによって回避することができます。
DABは、おそらくIHCの中で最も頻繁に使用される色素原です。 DAB（褐色の反応生成物）に加えて、使用中の他のペルオキシダーゼ色原体は、3-アミノ-9-エチルカルバゾール（AEC;赤色）であり、4-クロル-1-ナフトール（CN、青）及びテトラメチルベンジジン（TMB;青）。一般的に選択されたAPの色原体は、FB、ファーストレッド（FR）、新たなフクシンおよび5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル/ニトロBLありますUE塩化テトラゾリウム（BCIP / NBT）。酵素及び色素原の選択は、基本的に個々の好みの問題であるが、しかしながら、そのような局在、発現パターンとして対象地物によってだけでなく、内因性の色素（メラニン、ヘモジデリン）32の存在によって操縦されてもよいです。対比染色は通常ヘマトキシリン、核ファストレッドまたはメチルグリーン18を使用して行わIHC手順の最後、通性のステップです。一般的に、より適した単一標識のため、対比は、組織形態の解釈を容易にし、微妙に色素原の沈殿物との干渉を回避するために開発されるべきです。
染色手順の組織切片の完了時に慎重にマウンティング培地を使用してカバースリップでマウントする必要があります。気泡の発生は避けるべきです。物理的な保護のほかに、メディアをマウントすると、イメージングの可視化と品質が向上します。いずれかの有機/疎水性または水性/親水性、CH封入剤のOICEは、有機溶媒中で、最終生成物の溶解度に依存します。封入剤ベースのトルエンが適切であろうが、 例えば、DABのために、水性封入剤は、蛍光標識を含むすべての酵素の色素原に適用することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) | Baxter | 1001936060 | Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment. |
| Sodiumchloride (NaCl) | Merck | 1.0604 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% in 1x PBS | Apl pharma | 34 24 28 | Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity. |
| Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) | Sigma-Aldrich | 459844-1L | Flamable. |
| Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 | Sigma-Aldrich | 534056 | Flamable. Acute toxicity. |
| Histo-Comp Paraffin Wax | Tissue-Tek | V0-5-1001 | |
| Adhesive Microscope Slides | Starfrost | MIC-1040-W | |
| Xylol substitute XEM-200 | Vogel GmbH | ND-HS-200 | Respiratory sensitization. Carcinogenicity. |
| α-CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA48G | |
| α-Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody | Millipore | MABN92 | |
| α-CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA341R | |
| α-eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody | Santa Cruz BT | SC-6181 | |
| Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody | Dakopatts, Denmark | D0314 | |
| Biotinylated secondary antibody | Amersham Biotech | RPN1025 | |
| Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) | Sigma-Aldrich | A3151 | |
| Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) | Sigma-Aldrich | N4875-1G | Acute toxicity. |
| Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) | Sigma-Aldrich | FBS25 | |
| Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) | Sigma-Aldrich | 31742 | Acute toxicity. |
| 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) | DAKO | S3000 | Highly flammable. Toxic. |
| Copper sulphate (CuSO4) | Merck | 1.02791 | Acute toxicity. Environmental hazzard. |
| GelTol Aqueous Mounting Medium | Thermo Electron Corporation | 230100 | |
| Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) | Merck | 107210 | Acute toxicity. |
| Methanol (CH3OH) | Fluka | 65543 | Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable. |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) | AppliChem | A1379 | Skin and eye irritation. |
| Tris Buffered Saline (TBS), tablet | Sigma-Aldrich | T5030 | |
| Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) | Merck | 1.0658 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) | Merck | 1.06346 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Cambrex BioScience | DE-14-802F | |
| DAKO cytomation wash buffer 10x | DAKO | S3006 | Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming. |
| N,N-Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) | Fluka | 40250 | Flammable. Acute toxicity. |
| Glas coverslips 24 x 36 mm | Menzel-Gläser | BB024036A1 | |
| Hydrochloric acid, conc. (HCl) | Sigma-Aldrich | 30721 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Hydrochloric acid solution volumetric, 2 M HCl (2 N) | Fluka | 71826 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) | Sigma-Aldrich | S2252 | Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment. |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) | Merck | 1.08454 | Oral exposures may cause reproductive and developmental effects. |
| Equipment | |||
| Tissue-TekV.I.P Vacuum Infiltration Processor | Sakura | 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz | |
| Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome | Hacker instruments | ||
| Household food steamer | Braun | MultiGourmet FS 20 | |
| Light microscope | Leica Polyvar 2 | ||
References
- Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
- Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).
- Mason, D. Y., Sammons, R. Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use. Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).
- Polak, J. M., Van Noorden, S. Introduction to immunocytochemistry. , Bios Scientific Publishers Ltd. Oxford, UK. (2003).
- Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods. American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).
- Ramos-Vara, J. A.
- Adzemovic, M. Z., et al. Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats. PloS one. 7, 39794 (2012).
- Bauer, J., et al. Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes. Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).
- Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord. The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).
- Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).
- Hirasawa, T., et al. Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice. Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).
- Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules. Nature. 336, 79-81 (1988).
- Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).
- Hayat, M. Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy. , Kluwer Academic. New York. (2002).
- Boenisch, T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).
- Huang, S. N. Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).
- Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).
- Taylor, C. R., Shi, S. R. Antigen retrieval: call for a return to first principles. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).
- Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).
- Nelson, P. N., et al.
- Van der Loos, C. Immunoenzyme multiple staining methods. , Bios Scientifc publishers Ltd. New York. (1999).
- Elias, J. Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis. , ASCP Press. Chicago. (2003).
- Straus, W. Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).
- Streefkerk, J. G. Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).
- Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).
- Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones. Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).
- Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells. The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
