Summary
عملية الشفاء من الخلايا جرح ينطوي الاتجار بروتينات معينة ومقصورات التحت خلوية إلى موقع الإصابة غشاء الخلية. يصف هذا البروتوكول فحوصات لرصد هذه العمليات.
Abstract
قدرة الخلايا المصابة للشفاء هو عملية الخلوية الأساسية، ولكن الآليات الخلوية والجزيئية المشاركة في خلايا الشفاء بجروح ولا يزال الغموض يكتنف. هنا يتم وصف فحوصات لرصد القدرة وحركية للشفاء من إصابة الخلايا المستزرعة التالية مترجمة. يصف البروتوكول الأول نهجا يستند إلى نقطة النهاية في وقت واحد لتقييم قدرة الخلايا إصلاح غشاء من مئات الخلايا. يصف البروتوكول الثاني نهج التصوير في الوقت الحقيقي لمراقبة حركية إصلاح غشاء الخلية في الخلايا الفردية بعد الاصابة المترجمة مع ليزر نابض. كما أصيب خلايا الشفاء ينطوي الاتجار بروتينات معينة ومقصورات التحت خلوية إلى موقع الإصابة، ويصف البروتوكول الثالث استخدام نهج نقطة النهاية أعلاه استنادا إلى تقييم واحد مثل الاتجار الحدث (الليزوزومية إيماس) في مئات من الخلايا في وقت واحد وجرح بروتوكول مشاركة يصف استخدام الليزر النبضي الإصابة جنبا إلى جنب مع صغار TIRFنسخة لرصد ديناميات مقصورات التحت خلوية الفردية في الخلايا المصابة في القرار المكانية والزمانية عالية. في حين تصف بروتوكولات هنا استخدام هذه الأساليب لدراسة العلاقة بين إصلاح غشاء الخلية وإيماس الليزوزومية في خلايا العضلات مثقف، يمكن تطبيقها على هذا النحو لأية خلية أخرى ملتصقة مثقف ومقصورة التحت خلوية من خيار.
Introduction
يحافظ على غشاء الخلية على سلامة الخلايا من خلال توفير حاجز بين الخلية والبيئة خارج الخلية. A التحفيز الكيميائية والكهربائية والميكانيكية أو التي تتجاوز عتبة فسيولوجية طبيعية وكذلك وجود غزو مسببات الأمراض يمكن لكل نتيجة في إصابة غشاء الخلية وتثير رد فعل الخلوية اللاحقة لإصلاح هذا الضرر. البقاء على قيد الحياة هذه الإصابات لغشاء الخلية، والخلايا تمتلك آلية فعالة للإصلاح. هذه الآلية هي التي تعتمد الكالسيوم وينطوي الاتجار داخل الخلايا من البروتينات مثل annexins وMG53 وغيرها فضلا عن المقصورات التحت خلوية مثل الإندوسومات، الجسيمات الحالة، جولجي والميتوكوندريا الحويصلات المشتقة من غشاء الخلية أصيب 1-7. ومع ذلك، فإن تفاصيل تسلسل الأحداث الجزيئية والتحت خلوية المشاركة في إصلاح غشاء الخلية التالفة لا تزال غير مفهومة تماما.
يمكن فصل استجابة إصلاح الخلية في الأذنلاي والاستجابات في وقت متأخر. الردود في وقت مبكر، والتي تحدث في غضون ثوان إلى دقائق النطاق الزمني، مهمة بشكل كبير في تحديد طبيعة الاستجابات في وقت متأخر مما يؤدي إلى إصلاح الخلية ناجحة أو موت الخلية. وقد ساعدت المقايسات نقطة النهاية على أساس الأكبر تحليل الكيمياء الحيوية والخلوية إثبات تورط العمليات الجزيئية والخلوية في الإصلاح. ولكن، نظرا لعدم التجانس وسرعة الاستجابة إصلاح الخلوية، تفشل المقايسات نقطة النهاية لتقديم التفاصيل الحركية والمكانية للتسلسل الأحداث التي أدت إلى إصلاح. هي مناسبة النهج التي تمكن من إصابة تسيطر غشاء الخلية وتسمح برصد إصلاح غشاء الخلية والاستجابات المرتبطة التحت خلوية في القرار المكانية والزمانية عالية مثالي لمثل هذه الدراسات. هنا، وقد عرضت هذه النهج. اثنين من البروتوكولات وصف النهج لرصد حركية في الوقت الحقيقي من إصلاح غشاء الخلية والردود التحت خلوية المرتبطة بعملية الإصلاح في الخلايا الحية التالية ينج الليزرأوروغواي. كتكملة لهذه المقايسات التصوير الخلية الحية تستند، كما تم وصفها المقايسات نقطة النهاية التي توفر مقياسا على السكان لإصلاح رصد الخلايا الفردية وردود التحت خلوية المرتبطة بها. لإثبات فائدتها وقد استخدمت هذه الأساليب لمراقبة الاتجار وإيماس من الجسيمات الحالة في استجابة لإصابة غشاء الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التصوير خلية اصلاح غشاء طريق السائبة (الزجاج الخرزة) إصابة
هذا البروتوكول يسمح بمناسبة حدة خلايا المصابين وتلك التي تفشل للشفاء. قياس هؤلاء السكان من الخلايا يتطلب استخدام ثلاثة شروط: 1. اختبار (C1) - يسمح للخلايا لإصلاح في وجود كا 2 +، 2. الرقابة 1 (أي إصابة C2) - يتم تحضين الخلايا في وجود كا 2 +، ولكن لم يصب، و 3. السيطرة 2 (لا إصلاح C3) - يسمح للخلايا لإصلاح في غياب كا 2 +.
- تنمو الخلايا ل> 50٪ التقاء على ثلاثة coverslips معقمة وغسل C1 و C2 مرتين مع CIM عند 37 درجة مئوية وC3 مع برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية و coverslips نقل على السيليكون O-الخواتم.
- إضافة 100 ميكرولتر من حل prewarmed ديكستران FITC في CIM على C1 و C2 أو C3 في برنامج تلفزيوني على.
- إصابة غشاء البلازما على C1 و C3 من قبل المتداول بلطف 40 الخرز الزجاجي ميلي غرام على مدى ساترة في درجة حرارة الغرفة عن طريق إمالة coverslips يدويا ذهابا وإيابا 6-8 مرات في زاوية من 30 درجة.
ملاحظة: لإصابة خفيفة، وضمان وتنتشر حبات الزجاج بشكل موحد، وبالتالي التقليل من تكرار وقوع اصابات. لتحسين استنساخ الإصابة بين العينات، وتحمل في الوقت نفسه من الإصابة الزجاج حبة من عينات مختلفة ليتم مقارنتها. - تجنب المزيد من المتداول من الخرز، ونقل جميع coverslips إلى الحاضنة 37 درجة مئوية في ثاني المحيطة 2 والسماح الإصلاح والمضي قدما لمدة 5 دقائق.
- دون السماح الخرز لفة، وإزالة الخرز الزجاجي وFITC ديكستران بواسطة الغسيل مع CIM (C1 و C2) أو برنامج تلفزيوني (C3) في 37 درجة مئوية.
- مكان coverslips مرة أخرى على خاتم O وإضافة 100 ميكرولتر من prewarmed يسين يمكن حلها حلا TRITC دكستران في CIM على C1 و C2 أو C3 في برنامج تلفزيوني على.
- احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في ثاني المحيطة 2.
- غسل coverslips مرتين مع prewarmed CIM وإصلاح مع PFA 4٪ لمدة 10 دقيقة في RT.
- يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 2 دقيقة في RT في هويشت الصبغة.
- غسل samplوفاق مرتين مع برنامج تلفزيوني، جبل على شريحة باستخدام وسائل الإعلام وتركيب الخلايا صورة باستخدام مجهر epifluorescence.
- استخدام الخلايا من C2 إلى تحديد خلفية حمراء وخضراء وتلطيخ كثافة استخدام هذه القيمة إلى عتبة القنوات الأحمر والأخضر لجميع العينات (C1-C3).
- يسجل العدد الكلي للخلايا التي يتم أ) الأخضر (الجرحى وإصلاحه) وب) حمراء أو كليهما الأحمر والأخضر (المصاب، لكنها فشلت في إصلاح) في عينات C1 و C3.
- العد> 100 الخضر خلايا لكل حالة وتعبر عن جزء من الخلايا التي فشلت في إصلاح كنسبة مئوية من جميع الخلايا المصابة (الأخضر والأحمر).
2. التصوير المباشر لحركية إصلاح غشاء الخلية بعد الإصابة الليزر
- غسل الخلايا مع prewarmed CIM ومن ثم وضع ساترة في CIM مع وزير الخارجية صباغة.
- وضع ساترة في حامل في الحاضنة مرحلة أعلى الحفاظ على 37 درجة مئوية.
- حدد 1-2 مم 2 المنطقة من غشاء الخلية، وأشرق ل<؛ 10 ميللي ثانية مع ليزر نابض. تخفيف قوة الليزر من خلال البرنامج إلى 40-50٪ من الطاقة الذروة. الطاقة الأمثل يسمح إصابة متسقة، ولكن غير قاتلة، وهذا يجب أن يتحدد عن طريق التجربة والخطأ لكل صك على حدة وخلية الخط المستخدمة.
- لرصد إصلاح، صورة كل 10 ثانية في epifluorescence وbrightfield، بدءا قبل الاصابة وتستمر لمدة 3-5 دقيقة بعد الاصابة.
ملاحظة: للحصول على أي سيطرة إصلاح، كرر الخطوات من 2،1-2،4 مع الخلايا بجروح في برنامج تلفزيوني يحتوي على صبغة FM. - لقياس حركية إصلاح، وقياس FM الخلوية صبغ مضان ورسم التغير في كثافة (ΔF/F0) أثناء التصوير. ينبغي أن متوسط هذه البيانات لأكثر من 10 خلايا في كل حالة وخططوا كما بلغ متوسط قيمة الخلية أو الفرد، حسب الحاجة.
3. التصوير السائبة (الزجاج الخرزة) إصابة المستحثة الليزوزومية الإيماس
وتشمل عينات الخلايا التالية نمت ل> 50٪التقاء: 1. اختبار (C1) - الخلايا يسمح لإصلاح في وجود كا 2 +، 2. الرقابة 1 (C2، لا إصابة) - خلايا لا جرح ولا حضنت مع الأجسام المضادة الأولية، و 3. 2 السيطرة (C3؛ لا اصلاح) - خلايا يسمح لإصلاح في غياب كا 2 +.
- غسل coverslips C1 و C2 مرتين مع CIM عند 37 درجة مئوية وC3 مع برنامج تلفزيوني في 37 ° C ونقلها على السيليكون O-الخواتم.
- إضافة 100 ميكرولتر من prewarmed يسين يمكن حلها ديكستران TRITC في CIM على C1 و C2 و C3 في برنامج تلفزيوني على.
- إصابة غشاء البلازما على C1 و C3 كما في الخطوة 1.3.
- تجنب المزيد من المتداول من الخرز، ونقل جميع coverslips إلى الحاضنة 37 درجة مئوية في ثاني المحيطة 2 والسماح الإصلاح والمضي قدما لمدة 5 دقائق.
- إزالة الخرز الزجاجي وTRITC دكستران بغسل لل coverslips في متوسطة النمو الباردة، وضمان مرة أخرى لا المتداول من الخرز الزجاجي على الخلايا.
- شطف لل coverslips مرتين مع نمو الباردة متوسطة ونقل إلى O-الخواتم.
- لC1 و C3، إضافة 100 ميكرولتر من الفئران لمكافحة فأر LAMP1 الأجسام المضادة في وسائل الإعلام كاملة النمو البارد وإضافة الباردة، وسائط النمو الكامل لC2.
- للسماح الضد ملزمة coverslips احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- غسل coverslips ثلاث مرات مع CIM الباردة وإصلاح كافة coverslips مع PFA 4٪ لمدة 10 دقيقة في RT ثم شطف 3X مع CIM.
- احتضان جميع coverslips في 100 ميكرولتر من عرقلة الحل لمدة 15 دقيقة في RT
- احتضان جميع coverslips في 100 ميكرولتر اليكسا فلور 488 الضد مكافحة الفئران لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 2 دقيقة في RT في هويشت.
- غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني، جبل على شريحة باستخدام وسائل الإعلام وتركيب الصورة باستخدام المجهر epifluorescence.
- استخدام الصور من الخلايا C2، تحديد تلطيخ غير محدد الخلفية في المنطقة الحمراء (TRITC دكستران) والأخضر (اليكسا فلور 488 الضد) القنوات واستخدام هذه القيم لتلوين الخلفية عتبة القنوات الأحمر والأخضر لجميع العينات (C1-C3). </ لى>
- استخدام> 100 الأحمر وصفت الخلايا من C1 و C3 لقياس شدة تلطيخ LAMP1 (الأخضر) في الخلايا المصابة. تجربة ناجحة لتلطيخ LAMP1 في الخلايا من C3 سيكون أقل بكثير مما كانت عليه في الخلايا من C1.
4. التصوير الحي للخلية غشاء الإصابات الحفز الاتجار التحت خلوية
- تسمية Fluorescently و مقصورة الفائدة عليها بنقل مراسل المناسبة (مثل CD63-GFP لالجسيمات الحالة 8) أو باستخدام الأصباغ الفلورية 9.
- لوضع العلامات الجسيمات الحالة مع صبغة الفلورسنت، واحتضان الخلايا المزروعة إلى 50٪ التقاء في وسائل الإعلام التي تحتوي على النمو FITC-ديكستران
- تسمح ديكستران أن endocytosed لمدة 2 ساعة (أو أكثر حسب الحاجة لوضع العلامات endosomal كافية مع ديكستران من خط الخلية من الفائدة) في حاضنة CO 2.
- غسل الخلايا مع وسائل الاعلام prewarmed النمو واحتضان فيه لمدة 2 ساعة في CO 2 حاضنة للسماح للجميعendocytosed ديكستران لتتراكم في يحلول.
- قبل التصوير، وشطف ساترة في prewarmed CIM وجبل في حامل ساترة على الحاضنة المرحلة الأولى في 37 درجة مئوية.
- تنفيذ widefield (للحركة في جميع أنحاء الخلية) أو TIRF (الحركة على سطح الخلية وإيماس) التصوير - الخلايا التي ليس لديها مزدحمة FITC ديكستران الجسيمات الحالة وصفت هي مثالية لتصوير الحركة وإيماس من الجسيمات الحالة الفردية.
- محاذاة الليزر TIRF المجهر التصوير ل: استخدام 60X أو 100X مع الهدف> 1.45 NA. إعداد زاوية لحادث TIRF شعاع الليزر باستخدام نهج الشركة المصنعة.
- إصابة غشاء الخلية عن طريق تشعيع منطقة صغيرة (1-2 مم 2) ل<100 ميللي ثانية، مع ليزر نابض في 40-50٪ التوهين.
- لرصد استجابة يحلول إلى الخلية الإصابة، خلايا الصورة في 4-6 لقطة / ثانية لمدة 2 دقيقة على الأقل أو أكثر اعتمادا على ديناميات إيماس في الخلايا من الفائدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
البروتوكولات وصفها هنا للتصوير خلية واحدة هي القدرة على رصد وحركية إصلاح غشاء الخلية (البروتوكولات 1 و 2) والاتجار التحت خلوية والانصهار من خلال إصلاح الجسيمات الحالة (بروتوكولات 3 و 4).
بروتوكول 1 يظهر الفحص الأكبر الذي يسمح وضع علامات على جميع الخلايا المصابة وتحديد تلك الخلايا المصابة التي فشلت في إصلاح. النتائج في الشكل 1 المعرض أنه في حين أن الخلايا لم يصب (الشكل 1A) لا تزال غير المسماة، وصفت الخلايا أصيب الزجاج حبة في وجود FITC ديكستران الخضراء (الأرقام 1B و 1C). عندما يسمح لإصلاح الخلايا في وجود كا 2 + معظم المصابين (الأخضر) خلايا لإصلاح إدارة ولم يتم وضع علامة (حمراء) من خلال TRITC دكستران (الشكل 1B). عندما يسمح لإصلاح الخلايا في غياب كا 2 +، وصفت معظم الخلايا المصابة أيضا الأحمر من قبل ديكستران TRITC (فايجوري 1C). الخلايا التي أصيب أبدا لا تظهر أي وضع العلامات مع ديكستران TRITC. وهكذا، في أي عينة تعطى تحديد عدد الخلايا يوفر فقط وصفت الخضراء قدرا من الخلايا التي أصيب من قبل الخرز الزجاجي وإصلاحه، في حين تحديد عدد الخلايا مزدوجة (الأحمر والأخضر) وصفت يوفر قدرا من الخلايا التي فشلت لإصلاح من الاصابة.
بروتوكول 2 يصف تقييم حركية إصلاح غشاء الخلية من خلال مراقبة دخول الصبغة FM في الخلية. عندما حضنت في صبغ FM، تظهر خلايا سليمة تلطيخ غشاء الخلية (الشكل 2A قبل الإصابة وحة WF). التالية مترجمة إصابة الليزر من غشاء الخلية صبغ FM يبدأ دخول الخلية وendomembranes، والذي يسبب زيادة مفاجئة في FM صبغ مضان (الشكل 2B) ملزمة. كما قدرة غشاء الخلية لإصلاح بعد الاصابة الليزر يعتمد على كا 2 +، خلية بجروح في وجود كا 2 + هو أبلو لإصلاح، الذي يتسبب في دخول الصبغة FM (وبالتالي زيادة في الخلوية FM صبغ مضان) لوقف في غضون دقيقة بعد الإصابة (الشكل 2A، اللوحة العليا، الشكل 2B، الخط الأزرق، والرسوم المتحركة والفيديو 1 الشكل 2). على العكس من ذلك، يسمح للخلية إصلاح في غياب كا 2 +، فشل لإصلاح، والذي ينتج في دخول الصبغة المستمر وبالتالي الزيادة المستمرة في FM صبغ مضان حتى 4 دقائق بعد الإصابة (الشكل 2A، اللوحة السفلى، الشكل 2B، خط أحمر والرسوم المتحركة الفيديو 2 والشكل 2). وبالتالي، وإصلاح غشاء الخلية يؤدي إلى plateauing من الصبغة تلطيخ FM، في حين عدم وجود إصلاح غشاء الخلية يسبب دخول الصبغة المستمر الذي فشل في الهضبة.
بروتوكول 3 يصف استخدام الجزء الأكبر (الزجاج حبة) نهج الإصابة لمراقبة إزفاء سطح الخلية من الحويصلات والبروتينات ردا على الاصابة. هنا عشروأصيب الخلايا ه بحضور TRITC دكستران بالتالي، في حين لم تتم تسمية الخلايا لم يصب الحمراء (الشكل 3A)، ولكن وصفت جميع الخلايا المصابة حمراء (أرقام 3B و 3C). الخلايا لم يصب التي لا يتم التعامل مع وضع العلامات مستوى الأجسام المضادة الأولية تظهر خلفية لLAMP1 سطح الخلية (الشكل 3A وحة LAMP1). ومع ذلك، عندما يتم إصابة الخلايا ويسمح للشفاء في وجود الكالسيوم، الجسيمات الحالة الخضوع إيماس، وبالتالي هناك زيادة مستوى LAMP1 تلطيخ على السطح من الجرحى (الأحمر المسمى) الخلايا (الشكل 3B). هذه الزيادة في وضع العلامات LAMP1 سطح الخلية هو أقل من ذلك بكثير في الخلايا التي يسمح للشفاء في غياب الكالسيوم (الشكل 3C). هذا يدل على طبيعة تنظيم الكالسيوم من الليزوزومية إيماس، وبالتالي ظهور سطح LAMP1. وبالتالي على حد سواء، تحديد عدد الخلايا مع سطح الخلية عالية LAMP1 تلطيخ وكذلك قياس مستوىمن سطح الخلية LAMP1 تلطيخ على الخلايا المصابة الفردية، وتوفير التدابير اللازمة لقدرة الخلية على الخضوع لاثار الاصابة الليزوزومية إيماس.
بروتوكول 4 يمكن استخدامها لمراقبة مباشرة لحركية، والطبيعة، وموقع الفرد الانصهار يحلول ردا على إصابة غشاء الخلية. وأصيب الخلايا بواسطة الليزر النبضي وسطح الخلية يتم تصوير الجسيمات الحالة من قبل TIRF التصوير، والذي يسمح تسبب الإصابة الرصد إيماس من الجسيمات الحالة في الخلايا الفردية (الشكل 4A والرسوم المتحركة فيديو 3). ويبين الشكل 4A خلية (المبينة باللون الأخضر) تصور من قبل التصوير النقيض من المرحلة (اللوحة اليسرى) وTIRF المجهري (لوحة في الوسط)، قبل الاصابة. يظهر اللوحة اليمنى TIRF الصورة من نفس الخلية 105 ثانية بعد الاصابة. أثار إصابة مختلف ردود الجسيمات الحالة تم وصفها في أرقام 4B-E. ويبين الشكل 4B تسبب الإصابة التوظيف من يحلول (علامةمن قبل دائرة الرمادي) إلى غشاء الخلية تليها إيماس (الرسوم المتحركة فيديو 4 والشكل 4). هذا يحلول غير مرئية في TIRF الصورة قبل الإصابة (الشكل 4B: لوحة -2.5)، ولكن بعد الاصابة ليحلول يصل إلى غشاء الخلية ويصبح اكتشافها (الشكل 4B: لوحة 102.5 ق)، بينما يتحرك حويصلة أقرب إلى غشاء الخلية فمن الأفضل متحمس من الإضاءة TIRF والليزوزومية FITC ديكستران مضان تصل القيمة القصوى عند الانصهار المسام يفتح تسبب تحييد الحموضة الليزوزومية وبالتالي dequenching من FITC مضان ديكستران (الشكل 4B: لوحة 104.8 ق). لاحقا تبرأ ديكستران من حويصلة إلى السطح الخارجي للخلية مما يسبب FITC مضان لنشر أفقيا ومضان الحويصلة لتنخفض تدريجيا (الشكل 4B: لوحة 107.1 ق). في الفئة الثانية، ويحلول (تميزت دائرة البرتقال، والرسوم المتحركة فيدEO هو 5 الشكل 4) موجودا قبل الإصابة (الشكل 4C: لوحة -2.5 ق)، فإنه لا يزال هناك في الغشاء (الشكل 4C: لوحة ق 91) حتى exocytoses حويصلة. هنا يحلول exocytosed جزئيا (الشكل 4C: لوحة ق 93) تاركين وراءهم بعض ديكستران FITC في الحويصلة التالية الانصهار (الشكل 4C: 94.5 ق). الفئات الثالثة والرابعة من الحويصلات لا تلتحم لالغشاء. ويحلول هو مبين في الشكل 4D (تميزت الدائرة الزرقاء) يتحرك محوريا لوبعيدا عن غشاء الخلية (الرسوم المتحركة فيديو (6) والشكل 4). هذا يحلول غير مرئية في غشاء الخلية قبل الإصابة (الشكل 4D: لوحة -2.5)، ولكن عند الاقتراب غشاء الخلية بعد الاصابة يصبح مرئية بواسطة المجهر TIRF (الشكل 4D: لوحة 59.3 ق). وصلت الأقرب إلى غشاء الخلية (الشكل 4D: لوحة 59.6 ثانية) ثم يتحرك بعيدا دون الصمامات (الشكل 4D: عآنيل 63.7 ق). ويحلول في الفئة الرابعة تصل بالقرب من الغشاء ويتحرك أفقيا على طول غشاء الخلية (منطقة تميزت مربع الأرجواني في الشكل 4A، والرسوم المتحركة الفيديو 7 والشكل 4). الشكل 4E (لوحة 8.7 ق) يدل على وصول يحلول ، والتي تتحرك على طول ثم الغشاء، ويمكن مشاهدته في سلسلة من الصور بعد الإصابة (الشكل 4E: لوحات 10.7، 11.9، 12.8، 18.8 ق). استنادا إلى الوصف أعلاه قياس كثافة مضان FITC ديكستران كل يحلول - الصمامات (أرقام 4B و 4C)، والانتقال محوريا (الشكل 4D) أو تتحرك أفقيا (الشكل 4E) يسمح تحديد استجابة يحلول لإصابة.
الشكل 1. . الخلية الأكبر إصابة الغشاء بواسطة الخرز الزجاجي تظهر الصور تلطيخ النووية (هويشت، اللوحة اليسرى)، وإصابة (تلطيخ الخضراء - FITC ديكستران)، وخلايا غير المرممة (تلطيخ حمراء - TRITC دكستران)، ودمج الصور (دمج). (أ) الخلايا لم يصب في وجود الكالسيوم، (B) إصابة الخلايا في وجود الكالسيوم، و (C) إصابة الخلايا في غياب الكالسيوم. مقياس شريط 10 ميكرون. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 2. . في الوقت الحقيقي التصوير من إصلاح غشاء الخلية استجابة لإصابات الليزر (A) صورة من الخلايا (المبينة باللون البرتقالي) قبل الإصابة [اللوحة اليسرى - حقل مشرق (BF) و(برنامج التحصين الموسع) epifluorescence]، 5 ثانية، 1 دقيقة، وبعد 4 دقائق الاصابة. يشار إلى موقع الإصابة عن طريق السهم الأبيض. يظهر اللوحة العليا خلية بجروح في وجود الكالسيوم وانخفاض لوحة يظهر خلية بجروح في غياب الكالسيوم. (ب) رسم بياني يبين التغيير في FM صبغ تلطيخ (ΔF/F0) من الخلايا في لوحة وجرح في وجود الكالسيوم (الازرق) أو في غياب الكالسيوم (الحمراء). المنطقة حيث يدخل FM الصبغة وبالتالي زيادة وضع العلامات مضان كان يستخدم لتقدير حجم كثافة مضان. مقياس بار = 10 ميكرون). اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 3. إيماس التصوير الليزوزومية ردا على إصابة الأكبر. تظهر الصور تلطيخ النووية هويشت (الأزرق)، وسطح الخلية LAMP1 تلطيخ (الأخضر)، TRITC دكستران (الحمراء)، ودمج جميع قنوات (تراكب) من (A) خلايا يصب بأذى لا المسمى مع الأجسام المضادة الأولية، (B) خلايا المصاب يسمح للإصلاح في وجود الكالسيوم، و (C) خلايا المصاب يسمح لإصلاح في غياب الكالسيوم. مقياس شريط 10 ميكرون. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 4. التصوير في الوقت الحقيقي من الليزوزومية إيماس ردا على إصابة الليزر. الخلايا مع FITC ديكستران الجسيمات الحالة وصفت جرح بواسطة الليزر النبضي في وجود الكالسيوم. (أ) حدود الخلية التيأصيب يرد (باللون الأخضر): اللوحة اليسرى - حقل مشرق قبل الإصابة، لوحة المتوسطة - TIRF قبل الإصابة واللوحة اليمنى - 105 ق TIRF بعد الاصابة. يتم وضع علامة على موقع الإصابة التي كتبها مربع سماوي والمنطقة المشار إليها بواسطة ممثل أبيض / صناديق الأرجواني والدوائر الملونة داخل والتكبير في لوحات BE. لون حويصلة في الصورة خلية كاملة (الرمادي والبرتقالي والأزرق) يتوافق مع اللون في التكبير الصور من الجسيمات الحالة الفردية. يظهر وحة (B) اليسار مؤامرة لقيمة ΔF/F0 لمضان FITC من حويصلة المعينين بعد الاصابة. يظهر اللوحة اليمنى لقطات من حويصلة قبل الإصابة (-2.5 ق)، prefusion (102.5 ق)، والانصهار (104.8) و postfusion (107.1 ق). يظهر وحة (C) اليسار مؤامرة لقيمة ΔF/F0 لمضان FITC من حويصلة رست قبل الاصابة. يظهر اللوحة اليمنى لقطات من حويصلة قبل الإصابة (-2.5 ق)، prefusion (91 ق)، والانصهار (93 ق) وpostfusion (94.5 ثانية). (<يظهر وحة قوية> D) اليسار مؤامرة لقيمة ΔF/F0 لمضان FITC من حويصلة تتحرك محوريا (نحو وبعيدا عن غشاء الخلية). يظهر اللوحة اليمنى لقطات من حويصلة قبل الإصابة (-2.5 ق)، وبعد إصابة في موقف مختلف بالقرب من الغشاء في 59.3، 59.6 و 63.7 ث. (E) لقطات من الحويصلة التي انتقلت أفقيا على طول غشاء الخلية في مواقع مختلفة قبل الإصابة (-2.5) و بعد إصابة في (8.7، 10.7، 11.9، 12.8 و 18.8 ق). شريط النطاق (A = 10 ميكرون، B، C، D، E = 1 ميكرون). اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرسوم المتحركة الفيديو 1 الشكل 2: . التصوير في الوقت الحقيقي من إصلاح غشاء الخلية استجابة لإصابات الليزر في وجود الكالسيوم بجروح دخول الصبغة FM في خلية (المبينة باللون البرتقالي) بواسطة نابضالليزر في وجود الكالسيوم. الفيلم يمثل 200 الصور المكتسبة كل 2 ثانية. أصيب الخلية (منطقة تميزت الساحة السماوي) بعد الإطار 4. يظهر الطابع الزمني الوقت في ساعة: دقيقة: ثانية: تنسيق ميللي ثانية. مقياس بار = 10 ميكرون.
الرسوم المتحركة الفيديو 2 الشكل 2: . الوقت الحقيقي التصوير من إصلاح غشاء الخلية استجابة لإصابات الليزر في غياب الكالسيوم دخول FM صبغ في خلية (المبينة باللون البرتقالي) أصيب ليزر نابض في غياب الكالسيوم. الفيلم يمثل 200 الصور المكتسبة كل 2 ثانية. أصيب الخلية (منطقة تميزت الساحة السماوي) بعد الإطار 4. يظهر الطابع الزمني الوقت في ساعة: دقيقة: ثانية: تنسيق ميللي ثانية. مقياس بار = 10 ميكرون.
الرسوم المتحركة الفيديو 3 الشكل 4: التصوير في الوقت الحقيقي من الليزوزومية exocytعمليات التفتيش الموقعي في استجابة لإصابة الليزر. استجابات مختلفة من الجسيمات الحالة في خلية (المبينة باللون الأخضر، فيديو 3) أصيب ليزر نابض. يمثل الفيلم 2 دقيقة من متتابعة الصور الفاصل الزمني التي حصل عليها TIRF المجهري في 5 لقطة / ثانية. تم الحصول على الصور Brightfield كل 20 ثانية. أصيب الخلية (المشار إليها بواسطة مربع سماوي) في 2 ثانية إلى هذا الفيديو. الدوائر الملونة (الرمادي والبرتقالي والأزرق) ومربع الأرجواني بمناسبة الجسيمات الحالة الموصوفة في الرقم 4 ومقاطع الفيديو المتحركة 4-7، مما يدل على مصائرهم متنوعة التالية إصابة الخلية. يظهر الطابع الزمني الوقت في ساعة: دقيقة: ثانية: تنسيق ميللي ثانية. مقياس بار = 10 ميكرون.
الرسوم المتحركة الفيديو 4 الشكل 4 يوضح يحلول exocytic تميزت الدائرة الرمادية التي يتم تجنيده لغشاء ردا على الاصابة. في 7 ثانية (إصابة آخر 5 ثانية) في هذا الفيديو يحصل جند يحلول في غشاء الخليةثم تدمج في هذا الموقع في 1 دقيقة و 47 ثانية. شريط النطاق = 1 مم.
الرسوم المتحركة الفيديو 5 الشكل 4 يوضح يحلول exocytic تميزت دائرة البرتقال التي كانت راسية في الغشاء قبل الاصابة والصمامات في هذا الموقع 1 دقيقة و 35 ثانية. شريط النطاق = 1 مم.
الرسوم المتحركة الفيديو 6 الشكل 4 يوضح الجسيمات الحالة تميزت الدائرة الزرقاء تتجه نحو ثم بعيدا عن غشاء الخلية. شريط النطاق = 1 مم.
الرسوم المتحركة الفيديو 7 الشكل 4 يوضح منطقة من الخلية التي تميزت مربع الأرجواني في فيديو 3 بعد الاصابة حيث واحدة من يحلول (دائرة بيضاء) يتحرك الأونج غشاء الخلية. شريط النطاق = 1 مم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إصابة غشاء الخلية في الجسم الحي يحدث نتيجة لمجموعة متنوعة من الضغوطات الفيزيولوجية ولقد تم تطوير العديد من الطرق التجريبية لتقليد هذه. وتشمل هذه إصابة غشاء الخلية من الخلايا الملتصقة عن طريق كشط لهم قبالة صحن أو الركض من خلال الضيقة تتحمل حقنة 9،10. بعد هذه الإصابات شفاء الخلايا في التعليق ولم تلتزم المصفوفة خارج الخلية كما يفعلون عادة في الأنسجة. آخرون، مثل استخدام السموم المسام تشكيل يغير كيميائيا غشاء الخلية عن طريق استخراج الدهون مثل الكوليسترول، وبالتالي لا يقلد في الإصابات الميكانيكية فيفو 5. وبالتالي، يمكن أن الطريقة المستخدمة لإصابة الخلية يؤثر على ما يمكن تعلمه حول استجابة الإصلاح. هذا يتطلب ممارسة الحذر ليس فقط في اختيار الفحص إصابة الخلية، ولكن أيضا اختيار النهج التي تحاكي أفضل الإصابات الميكانيكية في الجسم الحي. وتشمل هذه النهج إصابة الصفر (حيث أصيب أحادي الطبقة من الخلايابواسطة مشرط أو إبرة) والخرز الزجاجي إصابة (حيث تسبب في إصابة من قبل الخرز الزجاجي التدحرج خلايا الالتزام). هي مناسبة هذه الأساليب جيدا لإصابة الخلايا بشكل جماعي، ولكنها ليست قابلة للتصوير في الوقت الحقيقي من عملية إصلاح غشاء الخلية. استخدام microneedles والليزر النبضي لخلق إصابات محلية وتسيطر عليها بشكل جيد في نقطة تأثير تحاكي إصابة الميكانيكية والمؤلمة في الجسم الحي وقابلة للتصوير في الوقت الحقيقي للاستجابة إصلاح، ولكن يقدم نظرة ثاقبة إصلاح خلية واحدة في كل مرة. تجدر الإشارة إلى أن النهج إصابة ليزر نابض يتميز عن استخدام الإشعاع طويلة من غشاء الخلية مع الليزر nonpulsed حيث تسببت في إصابة الغشاء عن طريق التسخين الموضعي، والذي يعرف على إحداث تأثيرات nonphysiological مثل الضرر photoxidative وحراري ضوئي؛ لغشاء الدهون والمكونات عصاري خلوي 11.
البروتوكولات الموصوفة هنا تسمح تسخير إمكانات واحد سو في نهج جماعي الإصابة، التي تعتمد على استخدام الخرز والزجاج، واحدة من نهج إصابة مترجم (ليزر نابض) لرصد القدرة، حركية والاتجار التحت خلوية المشاركة في إصلاح غشاء الخلية بعد الاصابة حجم ميكرون. هذه الأساليب هي مجانية للطرفين - إصابة الجزء الأكبر تمكن باستخدام السكان من الخلايا لتحديد العجز في القدرة إصلاح والاتجار التحت خلوية المرتبطة به. من خلال تمكين التصور في الوقت الحقيقي للإصلاح في الخلايا الفردية، والنهج إصابة الليزر يسمح تحديد ما ترتبط خطوة من إصلاح غشاء الخلية وما الأحداث التحت خلوية مع العجز في الإصلاح. وقد استخدم هذا النهج لرصد خلية إصلاح الغشاء في الكائنات الثديية واللافقاريات 7،12،13. بناء على احتياجات التجربة أي من هذين النهجين يمكن أن تستخدم في حد ذاته. ومع ذلك، عندما طبيعة العجز إصلاح غير معروف أو تشارك في آلية التحت خلوية رعملية له لا يعرف، وذلك باستخدام مزيج من هذين النهجين هو مفيد.
ويرجع ذلك إلى التقلبات الكامنة في عدد الخلايا المصابة بين العينات في نقطة النهاية مقرها المقايسات إصابة الخلية فمن الضروري تحديد بشكل مستقل عن الخلايا التي يتم بجروح، التي تمكنت من إصلاح وتلك التي فشلت في إصلاح. النهج إصابة الزجاج حبة وصفناها هنا يسمح بتحديد هذه الخلايا. عند تنفيذ حبة الزجاج اصابة فمن المهم أنه في حين تبذل جهودا لزيادة عدد الخلايا أصيب إصابات خفيفة أنفسهم حتى الخلايا لا تتلقى عدة ضربات. هذا أمر مهم لأن الإصابة المتكررة سوف يتسبب في الخلايا (انتقائي تلك التي هي فقيرة في الإصلاح) للموت وفصل من ساترة أثناء العملية. هذا من شأنه أن يؤدي إلى التقليل من الخلايا التي فشلت في إصلاح. من المهم أيضا لتجنب أي المتداول من خلال التعامل مع الخرز الزجاجي وغسل لل coverslips للقضاء على أي إصابة جديدةسيؤدي إلى تلطيخ الحمراء (الخلايا إيجابية كاذبة). هذا النهج للإصابة كما يسمح بمراقبة السكان من الخلايا لإزفاء سطح الخلية من البروتين من الفائدة، كما أثبتت هنا ليحلول يرتبط البروتين غشاء 1 (LAMP1). فقط عند رصد سطح الخلية البروتينات المترجمة بواسطة المناعي شرطا أساسيا لاستخدام الأجسام المضادة التي تربط المجال خارج الخلية من البروتين من الخلايا الفائدة وimmunolabel قبل التثبيت. وهذا يسمح بمقارنة مستوى LAMP1 في غشاء الخلية في الخلايا المصابة بخلايا لم يصب أو بين مجموعات مختلفة من الخلايا. في حين تم توضيح هذا البروتوكول باستخدام LAMP1، فإنه يمكن تطبيقها على أي بروتين أخرى يختارها التي يوجد جسم مضاد معين إلى مجال البروتين خارج الخلية. عندما يحتاج إصابة أثار الليزوزومية إيماس أن مقارنة بين اثنين من خطوط الخلايا التي لم أنشئ ليكون معدل القاعدية مماثلة (لا الناجمة عن الإصابة) من الليزوزومية إيماس، وينبغي أيضا قياس سطح الخلية LAMP1 تلطيخ على الخلايا لم يصب. لهذا يتم التعامل عينة إضافية مثلما C2 العينة إلا أنه في الخطوة 9 يجب تحضين الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية. هذا وسوف توفر مقياسا لمعدل القاعدية من الليزوزومية إيماس.
لبروتوكول إصابة الليزر يصابون أغشية الخلايا عن طريق كثافة عالية واحدة الفوتون NSEC ليزر نابض. ويتم جرح في وجود خلية الصبغة التي impermeant مضان يزيد على endomembrane ملزمة (على سبيل المثال FM 1-43). وبالتالي التالية الخلية المرتبطة مضان صبغ يوفر مقياسا للالوقت المستغرق من قبل الخلية للشفاء 3. إصابة الليزر يتسبب في صبغ FM بالدخول الى الخلية وربط endomembranes، مما أدى إلى زيادة في FM صبغ مضان. إصلاح غشاء الخلية التالفة يعوق دخول مزيد من الصبغة في الخلية. وبالتالي، لخلية أن الإصلاحات، مضان من صبغ تصل إلى الهضبة، في حين أن الخلية التي فشلت في إصلاح صبغمضان يزيد باستمرار.
التصوير الخلية الحية للأحداث التحت خلوية الفردية المشاركة في إصلاح غشاء الخلية يتطلب مراقبة غشاء الخلية في إشارة إلى ارتفاع نسبة الضوضاء. مجموع مضان انعكاس الداخلي (TIRF) المجهري هو نهج مناسبة تماما للأحداث سطح الخلية التصوير في إشارة إلى ارتفاع نسبة الضوضاء 14-16. هناك العديد من أنظمة TIRF المتاحة تجاريا وأي من هذه الأنظمة المتوافقة مع التصوير الخلية الحية يمكن استخدامها. بالإضافة إلى ذلك، وصفناها النهج لإقامة المجاهر TIRF محلية الصنع في أماكن أخرى 17،18. مستقلة عن الإعداد TIRF هناك حاجة إلى إنشاء النهج التي تسمح رصد مصائر مختلفة من الحويصلات التحت خلوية قبل وبعد الاصابة. في أماكن أخرى قدمنا مناقشة مثل هذه الأساليب التي تسمح رصد الطبيعة، والمدة، ودرجة الانصهار كل يحلول 19. لرصد الإصابات الناجمة إيماس من FITC-ديكستران المسمى lysosoMES الموصوفة في البروتوكول 4 الميزة الرئيسية لمراقبة هي ومضات. ينطوي على فلاش الإفراج عن FITC ديكستران الواردة في يحلول الفردية في خطوة واحدة مما أدى إلى انتشار الجانبي للمضان. في حين أن كل ومضة يشير عادة الانصهار exocytic من يحلول واحد، فمن المهم وضع هذا من خلال مراقبة كيفية العديد من الجسيمات الحالة موجودة في موقع الانصهار قبل وبعد الفلاش.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح AR055686 وAR060836 وزمالة ما بعد الدكتوراه لم من قبل جمعية الضمور العضلي الفرنسية (AFM). يتم دعم مرفق التصوير الخلوية المستخدمة في هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح HD040677.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma | H1387 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| HEPES | Fisher | BP410 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| FITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1820 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| Glass beads | Sigma | G8772 | |
| TRITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1818 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| PFA 16% | EMS | 15710 | 4% in PBS |
| Hoechst | Invitrogen | H3570 | 1/10 000 in PBS |
| FM dye | Invitrogen | T3163 | 1 µg/µl in CIM or PBS |
| FITC dextran | Sigma | FD40S | 2 mg/ml in growth medium |
| LAMP1 | Santa Cruz | sc-19992 | 1/300 in growth medium |
| Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG | Invitrogen | A21470 | 1/500 in blocking solution |
| Mounting media | Dako | S3023 | |
| Coverslips | Fisher | 12-545-86 | |
| Glass bottom petridish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Silicone O ring | Bellco | 1943-33315 | |
| Coverslip holder | Bellco | 1943-11111 | |
| Invitrogen | A-7816 | ||
| DMEM | VWR | 12001-566 | |
| FBS | VWR | MP1400-500H | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Penicillin/Sreptomycin | VWR | 12001-350 | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Chicken serum | Sigma | C5405 | 5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining |
| PBS (Ca2+ and Mg2+ free) | VWR | 12001-664 | |
| Epifluorescence microscope | Olympus America, PA | IX81 | |
| TIRF illuminator | Olympus America, PA | Cell^TIRF (IEC60825-1:2007) | |
| Epifluorescence illuminator | Sutter Instruments, Novato CA | Lambda DG-4 (DG-4 30) | |
| CCD Camera | Photometrics, Tucson, AZ | Evolve 512 EMCCD | |
| Image acquisition and anaysis software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Slidebook 5 | |
| Pulsed laser | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Ablate (3iL13) | |
| Stage top incubator | Tokaihit, Japan | INUBG2ASFP-ZILCS |
References
- Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Miyake, K., McNeil, P. L. Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. Blebbing confers resistance against cell lysis. Death Differ. 18, 80-89 Forthcoming.
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling. Cell Biol. 193, 455-464 (2011).
- Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).
- McNeil, P. L., Clarke, M. F., Miyake, K.
- McNeil, P. L. Direct introduction of molecules into cells. Protoc. Cell Biol. Chapter 20, (2001).
- Knight, M. M., Roberts, S. R., Lee, D. A., Bader, D. L. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. J. Physiol. Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).
- Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. Cell Biol. 168, 429-439 (2005).
- Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy. Cell Biol. 149, 23-32 (2000).
- Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. 388, 474-478 (1997).
- Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).
- Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Ch. 4.12. Current Protocols in Cell Biology. , Wiley and Sons Inc. 4.12.1-4.12.15 (2003).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).
- Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Imaging single events at the cell membrane. Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).
