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Biology

Bottom-up e espingarda Proteômica para Identificar um Comprehensive Coclear Proteome

Published: March 7, 2014 doi: 10.3791/51186
Automatic Translation
1, 1
1Department of Otolaryngology, Morsani College of Medicine, University of South Florida

Summary

Análise do proteoma do epitélio sensorial da cóclea pode ser um desafio, devido ao seu pequeno tamanho e porque as proteínas da membrana são difíceis de isolar e identificar. Tanto a membrana e proteínas solúveis podem ser identificados através da combinação de vários métodos de preparação e de técnicas de separação junto com espectrometria de massa de alta resolução.

Abstract

Proteômica é uma abordagem comumente utilizado, que pode fornecer insights sobre sistemas biológicos complexos. O epitélio sensorial da cóclea contém receptores que transduzem a energia mecânica do som para uma energia electro-química processada pelos sistemas nervosos periférico e central. Diversas técnicas têm sido desenvolvidas proteomic para estudar o ouvido interno da cóclea, tais como electroforese bidimensional em gel de diferença (2D-DIGE), anticorpo do microarray, e espectrometria de massa (MS). MS é a ferramenta mais abrangente e versátil em proteômica e em conjunto com métodos de separação pode fornecer um proteoma em profundidade de amostras biológicas. Os métodos de separação combinadas com MS tem capacidade para enriquecer amostras de proteína, detectar baixo peso molecular e as proteínas hidrofóbicas, e identificar proteínas abundantes baixas, reduzindo a gama dinâmica do proteoma. Estratégias diferentes de digestão pode ser aplicado a todo o lisado ou lisado de proteína fraccionada para aumentar peptídeo e proteínacobertura seqüência. Utilização de técnicas de separação diferentes, incluindo permuta catiónica forte (SCX), em fase inversa (RP), e electroforese fracção aprisionamento líquido eluído-gel (GELFrEE) podem ser aplicadas para reduzir a complexidade da amostra antes da análise por MS para a identificação das proteínas.

Introduction

Proteomics é o estudo dos sistemas biológicos complexos, analisando a expressão da proteína, função, modificações, e interacções 1. Vários métodos têm sido utilizados para a análise do proteoma do ouvido interno, incluindo o anticorpo microarray 2, electroforese em gel bidimensional, 3-5, e DIGE 6. No entanto, apenas um número limitado de proteínas foram identificadas e caracterizadas 2,7-10, em comparação com os 10.000 e os genes marcadores de sequências expressas (ESTs) identificados no ouvido interno, 11,12, MS é a técnica mais utilizada abrangente e em proteômica para a caracterização de proteínas. A análise de amostras de proteômica complexas, como a cóclea, pode ser um desafio. No entanto, a combinação de várias técnicas de separação com MS permite a identificação de um maior número de peptídeos e proteínas, devido a um aumento da gama de concentração e capacidade dinâmica de pico 13. Cromatog Multidimensionalphy reduz misturas de proteínas altamente complexas, permitindo o uso de diferentes mecanismos de adsorção. Há duas abordagens de análise do proteoma MS comumente utilizados, espingarda e proteômica bottom-up. Em proteómica espingarda, uma mistura de proteínas intactas é enzimaticamente digeridas e separados utilizando cromatografia multidimensional com cromatografia de troca catiónica forte (SCX), seguido por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) 14,15. Os péptidos separados são submetidos a MS em tandem e base de dados em busca 15. Uma importante vantagem desta técnica é que milhares de proteínas podem ser identificadas em uma única análise e a técnica é mais adequada para as proteínas da membrana.

Na abordagem de baixo para cima, a mistura de proteína é separada, normalmente por um ou electroforese bidimensional, e as bandas de proteínas individuais ou manchas cortadas e digeridas com uma enzima tal como a tripsina, geralmente resultando em péptidos múltiplos. No entanto, outra mais recentely desenvolvido abordagem eletroforética, usado em proteômica bottom-up, é GELFrEE. Esta técnica fracciona amostras de proteína em fase líquida e os torna menos complexo antes da análise. Esta técnica é reprodutível, oferece a recuperação da proteína, e diminui a distribuição de proteínas abundantes elevadas em amostras de complexos de proteínas 16. Peptídeos resultantes de proteínas separadas, são analisadas por MS, por meio de impressão digital em massa peptídeo ou conjunto MS (MS / MS), para criar etiquetas de seqüências do banco de dados em busca 17-19. Algumas das principais vantagens de se utilizar a abordagem bottom-up são a capacidade de obter separações de alta resolução e cobertura de proteína completa. Proteômica bottom-up é a técnica mais utilizada em proteômica 20, por isso, várias ferramentas de bioinformática estão disponíveis. Além disso, as proteínas podem ser separadas em uma complexa mistura, antes da digestão, para que haja uma maior chance de identificação.

Um dos maiores desafiosno uso do ouvido interno para análise proteômica é seu pequeno tamanho, a acessibilidade restrita, e tipo de célula diversidade 21. Além disso, as proteínas principais que distinguem a sua funcionalidade, como os canais de iões, os transportadores e os receptores, são proteínas de membrana, as quais podem ser difíceis de isolar 22. Assim, a preparação da amostra auxiliado por filtro (FASP) é vantajoso para análises proteômicas de tecidos que são limitados para a extração de proteínas e que necessitam de detergentes para solubilizar as membranas 23. Esta filtragem permite a análise MS da membrana e as proteínas solúveis e para a capacidade de isolar péptidos a partir de contaminantes de baixo peso molecular 23,24.

O presente protocolo descreve abordagens proteomic comumente utilizados que são combinadas e modificados para análise de proteínas, tanto solúveis e de membrana e para maximizar o número de IDs de proteína a partir do epitélio sensorial da cóclea. Vamos descrever usando proteômica shotgun com FASP multi-digeririônica, cromatografia de troca iônica, alta resolução MS, e análise de dados. Além disso, vamos descrever proteômica bottom-up com GELFrEE, FASP multi-digestão, alta resolução MS, e análise de dados.

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Protocol

Declaração de Ética

Experimentos utilizando tecido camundongos foram aprovados pela University of South Florida Animal Care Institucional e Comitê de Uso (Protocolos 3931R, 3482R), conforme estabelecido sob as diretrizes do National Institutes of Health.

1. Extração de Proteína

  1. Isolar epitélio sensorial da cóclea de 16 em 30 dias de idade (P30) camundongos CBA / J e armazenar a -80 ° C.
  2. No dia da experiência, lavar o tecido com 500 ul de 1x tampão de fosfatos salino (PBS). Centrifugar durante 3 min a 1000 xg, e remover o sobrenadante. Repetir para um total de três lavagens.
  3. Tecido Sonicar durante 30 segundos sobre gelo em 100 ul de tampão de lise contendo 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 120 mM, NaF 50 mM, 5 mM de EDTA, 500 ug / mL de AEBSF, 10 ug / ml de leupeptina, 100 ug / mL de pepstatina, 2 ug / ml de aprotinina, e 0,5 ug / ml usando um microcistina Dismembrator sónico (Modelo 100; Thermo Fisher). Lisado fresco no gelodurante 1 minuto entre cada sonicação. Sonicar um total de 3x.
  4. Centrifuga-se o extracto a 750 xg, a 4 ° C durante 2 min e remove-se o sobrenadante para um novo microtubo. Extrai-se a pelete em 50 ul de tampão de lise por sonicação durante 30 segundos em gelo. Centrifuga-se o extracto a 750 xg, a 4 ° C durante 2 min. Combinar os dois lisados ​​e centrifugar a 28.600 xg, a 4 ° C durante 60 min. Retirar o sobrenadante para um novo microtubo e adicionar 20 ul de tampão de lise contendo 0,1% de ASB-14 para o pelete. Vortex durante 1 minuto e incuba-se durante 60 min a 4 ° C.
  5. Aquece-se a amostra a 95 ° C durante 5 min, depois arrefece-se a 4 ° C durante 60 min. Seguir à centrifugação a 16.000 x g a 25 ° C durante 10 min. Recolhe-se o sobrenadante e transferir para um tubo novo.
  6. Centrifugar a suspensão a 16.000 xg, a 4 ° C durante 5 minutos e manter-se o sobrenadante para a digestão.

2. Duplo digestão de proteínas tríptico de Whole Lysate Usando FASP

  1. Adicionar a 30 μl alíquota (≤ 400 ug) de extracto de proteína coclear, contendo dodecilsulfato de sódio 4% (SDS), 100 mM Tris-HCl, pH 7,6 e 0,1 M ditiotreitol (DTT) directamente para um filtro de centrifugação 30K e misturar-se com 200 ul de 8 ureia M em Tris-HCl. Centrifugar a 14.000 xg por 15 min.
  2. Dilui-se o concentrado com 200 ml de solução de ureia 8 M e de centrifugação a 14.000 xg durante 15 min.
  3. Adicionar 10 ml de 10x iodoacetamida (IAA) 8 em solução M de ureia ao concentrado no filtro e vortex durante 1 min. Incubar o filtro de centrifugação durante 20 min à temperatura ambiente (TA) no escuro, seguido por centrifugação a 14.000 xg durante 10 min.
  4. Adicionar 100 ul de solução de ureia 8 M para o concentrado na unidade de filtragem e de centrifugação a 14.000 xg durante 15 min. Repita este passo 2x. Adicionar 100 ul de 50 mM de solução de bicarbonato de amónio (ABC) para a unidade de filtração e centrifugação a 14.000 xg durante 10 min. Repita este passo 2x.
  5. Adicionar 0,4 ug / uL de tripsina de 1:100 (w / w) da enzima-deProporção entre proteína e incubar durante a noite (O / N) a 37 ° C.
  6. Após a incubação, adicionar 40 ul de solução 50 mM de ABC unidade para filtrar e centrifugar a 14000 xg durante 10 min. Repita este passo 1x.
  7. Adicionar 50 ul de solução 0,5 M de NaCl para o filtro de centrifugação e centrifugar a 14000 xg durante 10 min. Transferir o filtrado contendo os peptídeos trípticos para um microtubo de fresco e acidifica-se com ácido fórmico (FA) a 1,0% para parar a digestão.
  8. Lava-se a unidade de filtração com 40 mL de 8 M de ureia, e em seguida lavar 2x com 40 ul de 18 mohms água.
  9. Lava-se a unidade de filtro com 3 x 100 mL de solução 50 mM de ABC. Após a lavagem final, adicionar 0,4 ug / uL de tripsina em 1:100 (w / w) proporção de enzima para proteína e incubar O / N a 37 ° C.
  10. Eluir péptidos trípticos a partir da segunda digestão através da adição de 40 ul de solução de ABC 50 mM para a unidade de filtração e centrifugação a 14.000 xg durante 10 min. Repita este passo 1x.
  11. Adicionar 50 ul de solução 0,5 M de NaCl para aunidade de filtragem e de centrifugação a 14.000 xg durante 10 min. Transferir o filtrado contendo os peptídeos trípticos para um microtubo de fresco e acidifica-se com FA a 1,0%.
  12. As amostras podem ser quantificadas utilizando o ensaio colorimétrico de microplacas usando BSA como padrão.

3. Endoproteinase LysC e Tryptic digestão de proteínas de Whole Lysate Usando FASP

  1. Adicionar uma parte alíquota de 30 ul (≤ 400 ug) de extracto de proteína coclear contendo 4% de SDS, Tris-HCl a 100, pH 7,6 e 0,1 M de DTT directamente para um filtro de centrifugação 30K e misturar-se com 200 mL de 8 M de ureia em Tris-HCl . Centrifugar a 14.000 xg por 15 min.
  2. Dilui-se o concentrado com 200 ml de solução de ureia 8 M e de centrifugação a 14.000 xg durante 15 min.
  3. Adicionar 10 ml de 10x IAA em 8 M de ureia solução ao concentrado no filtro e vortex durante 1 min. Incubar o filtro de rotação, durante 20 minutos à temperatura ambiente no escuro, depois centrifugar a 14000 xg durante 10 min.
  4. Adicionar 100 ul de ureia 8M sollução para o concentrado na unidade de filtro e centrifugar a 14000 xg durante 15 min. Repita este passo 2x. Adicionar 100 ul de solução 100 mM de ABC para a unidade de filtração e centrifugação a 14.000 xg durante 10 min. Repita este passo 2x.
  5. Adicionar 0,1 ug / uL de endoproteinase LysC em 1:50 (w / w) proporção de enzima para proteína e incubar O / N a 30 ° C.
  6. Após a incubação, adicionar 40 ul de uma solução 100 mM de ABC para a unidade de filtração e centrifugação a 14.000 xg durante 10 min. Repita este passo 1x.
  7. Adicionar 50 ul de solução 0,5 M de NaCl para o filtro de centrifugação e centrifugar a 14000 xg durante 10 min. Transferir o filtrado contendo os péptidos LysC para um microtubo de fresco e acidifica-se com FA a 1,0% para parar a digestão.
  8. Lava-se a unidade de filtração com 40 mL de 8 M de ureia, e em seguida lavar 2x com 40 ul de 18 mohms água.
  9. Lava-se a unidade de filtro com 3 x 100 mL de solução 50 mM de ABC. Após a lavagem final, adicionar 0,4 ug / uL de tripsina em 1:100 enzima-a-proproporção tein e incubar O / N a 37 ° C.
  10. Eluir péptidos trípticos por adição de 40 ul de solução de ABC 50 mM para a unidade de filtro e centrifugar a 14000 xg durante 10 min. Repita este passo 1x.
  11. Adicionar 50 ul de solução 0,5 M de NaCl para a unidade de filtro e centrifugar a 14000 xg durante 10 min. Transferir o filtrado contendo os peptídeos trípticos para um novo microtubo e acidificar com 1,0% FA.
  12. A amostra pode ser quantificada utilizando o ensaio colorimétrico de microplacas com BSA como padrão.

4. Peptídeos dessalinização Usando Colunas spin

  1. Activar uma coluna MacroSpin C 18 pela adição de 500 mL de acetonitrilo (ACN) e centrifugar a 1100 x g durante 1 min. Descarte o flow-through após a centrifugação.
  2. Equilibrar a coluna com 500 mL de 0,1% de FA e centrifugar a 1100 x g durante 1 min. Descarte o flow-through e repita este passo 1x.
  3. Adicione-se 500 ul de péptido a digerir a uma colunad centrifugar a 1.100 g durante 1 min. Se o volume da amostra é maior do que 500 mL, em seguida, repita este passo.
  4. Lava-se a coluna com 500 mL de 0,1% de FA e centrifugar a 1100 x g durante 1 min. Descartar o escoamento. Repita este passo 1x.
  5. Adicionar 250 ul de uma relação de 90:10 ACN-água para a coluna e centrifugar a 1100 x g durante 1 min. Coletar o eluente contendo os peptídeos dessalinizada e transferir para um novo microtubo. Repita este passo 1x.
  6. Seca-se a amostra de péptido dessalinizada numa centrífuga de vácuo e evitar que a amostra seque completamente.

5. Cromatografia de troca iônica

  1. Injectar 50-100 mg de amostra de proteína digerida para um 200 x 2.1 mm, 5 mM de coluna SCX (Polysulfoethyl A) para separar péptidos.
  2. Usar um gradiente de 2-40% de B ao longo de 50 min, com uma taxa de fluxo de 250 mL / min. O solvente A é formato de amónio 5 mM, pH 3,0 em 25% de acetonitrilo e 75% de DDH 2 O. Solvente B é formato de amónio 500 mM, pH6,0 em 25% ACN e 75% DDH 2 O.
  3. Monitorar as frações peptídicas a 280 nm e recolher as frações em intervalos de 2 minutos usando um coletor de fração.
  4. Fracções secas em um concentrador de vácuo e ressuspender em 500 ul de acetonitrilo a 50% em ddH2O contendo 5% de FA para auxiliar a remoção de sal.
  5. Frações Redry e armazenar a -80 ° C até que esteja pronto para usar para análise nano LC-MS/MS.

6. Acetona Precipitation

Antes da separação GELFrEE o sobrenadante proteína coclear tem de ser dessalinizada. Precipitação por acetona pode ser usado para dessalinizar e concentrar proteínas.

  1. Adicionar três volumes de acetona gelada para o sobrenadante da cóclea. Suavemente vortex e incubar a 20 ° CO / N.
  2. Centrifugar a mistura de amostra a 15.000 xg durante 15 min a 4 ° C e remove-se o sobrenadante.
  3. Lava-se a pelete 3x proteína com acetona gelada e centrifugar a 14000 xg durante 5 min a 4° C.
  4. Secar o pellet e dissolver em 112 mL de 18 mohms água.
  5. Determinar a concentração de proteína utilizando o ensaio colorimétrico de microplacas.

7. GELFrEE Fracionamento de Coclear Sensorial Epithelium

  1. Adicionar 30 ul de tampão de amostra de 5x (0,25 M Tris-HCl pH 6,8, 10% (w / v) de SDS, 50% glicerol, 0,5% (w / v) de azul de bromofenol) para a proteína dessalinizada suspenso em 112 ul de 18 mohms água.
  2. Adicionar 8 mL de 1 M DTT e aquece-se a 95 ° C durante 5 minutos para reduzir ligações de dissulfureto da proteína. Depois de aquecer permitir o arrefecimento até à temperatura ambiente.
  3. Adicione 8 ml de tampão de corrida para ânodo reservatório, 150 mL de tampão de corrida para provar câmara de coleta e 6 ml de tampão de corrida para o catodo reservatório.
  4. Remova qualquer buffer que pode ter corrido para a câmara de amostra-loading com uma pipeta.
  5. Carga de 150 ul (≤ 1 mg) da mistura de proteínas coclear, para dentro da câmara de carregamento de amostra utilizando uma Tr 8%é-acetato de cartucho com um intervalo de massa de 3,5-150 kDa.
  6. Menores eletrodos e fim instrumento tampa para começar a corrida.
  7. Na primeira vez em pausa no instrumento adicionar 2 ml de tampão de corrida para o reservatório cátodo e retomar prazo.
  8. A cada intervalo de uma pausa no instrumento, recolher a amostra da câmara de recolha de amostra, utilizando uma pipeta e adicionar a um microtubo de fresco rotulado. Lave os 2x câmara coleção com 150 mL de tampão de corrida e descarte.
  9. Adicionar 150 mL de tampão de corrida fresco para a câmara de coleta de amostras e retomar a corrida. Recolher as fracções de proteína ao longo de um período de tempo de 2,6 horas, num volume total de 150 ul / fracção.

8. 1E Eletroforese em Gel de GELFrEE Frações

Electroforese em gel 1D pode ser usado para visualizar os resultados de GELFrEE fraccionamento antes da digestão enzimática e análise MS. Fracções de proteínas GELFrEE pode ser separado num gel de 4-15% de Tris-HCl.

  • Mistura-se uma alíquota de 5 ul de cada fracção GELFrEE com 5 mL de tampão de diluição da amostra (DTT 350 mM em tampão de amostra).
  • Aquecer as amostras a 95 ° C durante 3 min.
  • Amostras legal para RT.
  • Coloque 10 ml de cada fração GELFrEE em pistas de gel individuais e carga de 5 mL de padrão de peso molecular na última faixa não utilizada.
  • Submeter o gel a 125 V durante 1,5 horas ou até a frente do corante atingir o fundo do gel.
  • Retire cuidadosamente o gel e manchar com a Silver Stain Plus para visualizar a separação de proteínas.

    • 9. Digestão de proteínas de frações GELFrEE Usando FASP

    Um procedimento FASP modificado é usado para a remoção do detergente e digestão das fracções GELFrEE.

    1. Adicionar a cada fracção indivíduo directamente para uma unidade de filtro de 30K e misturar com 200 mL de 8 M de ureia em Tris-HCl e centrifuga-se a 14.000 xg durante 25 min.
    2. Dilui-se o concentrado com 200 ml de solução de ureiae centrifuga-se a 14.000 xg durante 12 min. Repita este passo 1x.
    3. Adicionar 10 ml de 10x IAA em solução de ureia ao concentrado em cada unidade de filtro, vortex durante 1 min, e incubar durante 30 min à temperatura ambiente no escuro.
    4. Adicionar 100 ul de solução de ureia para o concentrado sobre as unidades de filtragem e de centrifugação a 14.000 xg durante 15 min. Repita este passo 2x. Adicionar 100 ul de solução 100 mM de ABC para as unidades de filtro e de centrifugação a 14.000 xg durante 10 min. Repita este passo 2x.
    5. Adicionar 0,1 ug / uL de LysC de 1:50 (w / w) proporção de enzima para proteína para as unidades de filtro e incubar O / N a 30 ° C.
    6. Após a incubação, adicionar 40 ul de uma solução 100 mM de ABC para os filtros de spin e centrifugar a 14000 xg durante 10 min. Repita este passo 1x.
    7. Adicionar 50 ul de solução 0,5 M de NaCl para os filtros de spin e centrifugar a 14000 xg durante 10 min. Transferir o filtrado contendo os peptídeos IysC de cada filtro de giro para um novo microtubo e acidificar com trifluoroacácido etic (TFA).
    8. Lave os filtros de spin com 40 l de 8 M de uréia, em seguida, lavar 2x com 40 mL 18 mohms água.
    9. Lave os filtros de spin 3x com 100 ul de solução 50 mM de ABC. Após a lavagem final, adicionar 0,4 ug / uL de tripsina em um 1:100 (w / w) proporção de enzima para proteína e incubar O / N a 37 ° C.
    10. Eluir péptidos trípticos a partir de cada unidade de filtro através da adição de 40 ul de solução 50 mM de ABC e centrifugar a 14000 xg durante 10 min. Repita este passo 1x.
    11. Adicionar 50 ul de solução 0,5 M de NaCl para as unidades de filtro e de centrifugação a 14.000 xg durante 10 min. Transferir o filtrado contendo os peptídeos trípticos de cada unidade de filtro para uma nova microtubo e acidifica-se com TFA.
    12. Seque todas as digere em um concentrador de vácuo.

    10. Preparação de Amostras para LC-MS/MS

    1. Reconstituir seca LysC e péptido tríptico digere fracções em 20 ul de 0,1% de FA e vortex.
    2. Centrifugar as amostras a 20.000 xg durante 10min e remover a parte superior de 95% da amostra para um novo frasco de amostra.
    3. Injectar 5 ul de cada fracção de péptidos numa armadilha 100 mm x 25 mm da amostra para remover sais e contaminantes e realizar a separação cromatográfica sobre uma coluna de 18 mM 75 cm por 10 cm C.
    4. Usar um gradiente de 2-40% de B ao longo de 100 minutos, com um caudal de 200 nl / min. O solvente A é de 95% ddH2O e 5% de acetonitrilo contendo 0,1% de FA. Solvente B é 80% de ACN e 20% ddH2O contendo 0,1% de FA.
    5. Colete dez espectros de massa em tandem para cada MS varredura em um espectrômetro de massa de alta resolução. Um espectrômetro de massa LTQ Orbitrap foi utilizado neste experimento.

    11. Identificação de Proteínas

    1. Identificar proteínas usando o banco de dados do mouse UniProt contendo ambos frente e verso seqüências de proteínas e contaminantes comuns. Software MaxQuant com MASCOTE motor de busca é usado para pesquisar o banco de dados de proteínas.
    2. Os parâmetros de pesquisa que podem ser utilizados incluem; modific fixadoção de carbamidomethyl de cisteína, modificações variáveis ​​de oxidação da metionina, proteínas acetilação N-terminal, no máximo, 2 perdeu clivagem. O comprimento mínimo do péptido a considerar para a identificação é de 6 aminoácidos. Introduzir um erro de concentração da massa dos péptidos de ± 8 ppm e uma tolerância de massa fragmento de 1,2 Da (massa de erro é dependente do espectrómetro de massa que é utilizado).
    3. No software MaxQuant, utilizar uma taxa de detecção falso 1% (FDR) para o péptido e proteína de identificação. Identificação de proteínas é listado com o número de peptídeos combinados, a cobertura seqüência por cento de proteína, e as sequências de peptídeos.

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    Representative Results

    Para obter o proteoma mais abrangente do epitélio sensorial da cóclea, a dissecção do tecido rápida é necessária antes da extração de proteínas e de preparação da amostra. Duas técnicas proteômicas pode ser usado, de espingarda e bottom-up proteômica. Para preparar amostras para proteómica espingarda, procedimento de digestão FASP foi utilizado como ilustrado na Figura 1. O método permite que FASP para concentração de proteínas, a remoção de detergentes, e a digestão de proteínas, utilizando várias enzimas. Havia dois processos de digestão dupla utilizadas, a primeira foi uma digestão tríptica seguido por uma segunda digestão com tripsina, que foram reunidas, fraccionadas numa coluna de SCX-se em 18 fracções e analisadas por nano CL-EM/EM. Um total de 1.485 proteínas foram identificadas com um FDR de 1% ao executar um único prazo LC-MS/MS usando essa abordagem experimental. Entre as proteínas identificadas, 329 e 258 proteínas foram categorizados em mitocôndria e membrana de plasma, respectivamente (Figura2A). O segundo procedimento de dupla digestão consistiu de digestão LysC seguido por digestão com tripsina. Cada digest foi carregado individualmente e separada na coluna de SCX em 18 fracções e analisadas por nano CL-EM/EM. Os resultados da digestão de tripsina e LysC produzido um total de 3503 proteínas com um 1% FDR. Figura 2B mostra que 605 e 617 proteínas foram categorizados em mitocôndria e membrana de plasma, respectivamente. Esta abordagem forneceu o maior número de identificações de proteína associada à membrana. Análise em duplicado do LysC e frações de tripsina mostrou que mais de 65% das proteínas identificadas foram compartilhados entre os experimentos. No entanto, havia também as proteínas recém-identificadas na análise replicar. Os péptidos e as proteínas adicionais foram identificados devido a pequenas alterações na cromatografia, por conseguinte, levando a diferentes péptidos para fragmentação 25.

    Proteômica bottom-up foi aplicado utilizando GELFrEE fracionamentoantes de LC-MS/MS como ilustrado na Figura 3. Havia 12 frações GELFrEE coletados. Antes da digestão e análise de CL-EM/EM, de um gel corado com prata foi preparada para visualizar os resultados do fraccionamento GELFrEE como ilustrado na Figura 4. O gel mostrou a separação de proteínas, aumentando o peso molecular de cada fracção consecutivo. Portanto, as 12 fracções líquidas GELFrEE foram digeridos utilizando duas abordagens diferentes de digestão várias FASP e analisadas por LC-MS/MS. A primeira abordagem digestão foi realizada utilizando uma digestão com tripsina dupla, que levou à identificação de 2.165 proteínas com um FDR de 1% ao executar uma LC-MS/MS prazo único. Figura 5A mostra que houve 516 e 399 proteínas categorizados em mitocôndria e membrana de plasma, respectivamente. A segunda abordagem foi realizada utilizando digestão com endoproteinase LysC seguido por digestão com tripsina. Análise LC-MS/MS Único prazo identificados 2.211 proteínas com um FDR de 1%. Esteabordagem mostrou um número semelhante de proteínas associadas a membranas, como quando se utiliza a abordagem de tripsina / tripsina (Figura 5B). Os dados de proteômica de espectrometria de massa foram depositados na ProteomeXchange Consortium 26 com o identificador de conjunto de dados PXD000231 25. Combinando os resultados das diferentes técnicas resultou em um grande número de membrana e de proteínas solúveis a partir do epitélio sensorial da cóclea do rato (Figura 6).

    Figura 1
    Figura 1. Esquema de uma espingarda experimento proteômica usando FASP, cromatografia de troca iônica e de alta resolução MS. Proteínas são extraídos, solubilizado, e digerido usando FASP com LysC e endoproteinases tripsina. O LysC (tubo verde) e peptídeos trípticos (roxo tubo) são separadas em fracções menos complexas utilizando cromatografia SCX e analisados ​​usando nano CL-EM/EM. O motor de busca MASCOTE foi usado para processar os dados de MS para identificação de proteínas. Clique aqui para ver imagem ampliada.

    Figura 2
    Figura 2. GO componentes celulares perfil de IDs de proteína quando se realiza uma (A), primeiro e segundo a digestão com tripsina seguida por separação de SCX e (B) primeiro a digestão com LysC seguido por uma segunda digestão com tripsina seguida por separação de SCX. Todas as categorias são contados nonexclusively, quando uma proteína tem mais de uma categoria de componentes celulares."target =" _blank es.jpg "> Clique aqui para ver imagem ampliada.

    Figura 3
    Proteínas Figura 3. Esquema de um bottom-up experimento proteômica usando GELFrEE, FASP, e de alta resolução MS. Extraídos são dissolvidos e proteínas são precipitadas com acetona (tubo azul) para remover os sais e contaminantes indesejados do lisado. O pelete de proteína é solubilizado e as proteínas fraccionadas utilizando GELFrEE. Cada fracção foi digerido usando FASP com LysC e tripsina endoproteinases. O LysC (tubos verdes) e peptídeos trípticos (tubos de roxo) de cada fração são analisados ​​utilizando LC-MS/MS nano e proteínas identificadas através de pesquisa de dados MS usando MASCOTE. Clique aqui para ver grande imagem r.

    Figura 4
    Figura 4. Gel corado com prata das fracções GELFrEE epitélio sensorial da cóclea, para visualizar a separação de proteínas em cada fracção antes da análise por MS. (M) marcador de proteína, (1) A fracção 1, (3) a fracção 2, (5) Fracção 5, (7) A fracção 7, (8) Fracção 8, (9) Percentagem de 9, (10) A fracção 10, (11) A fracção 11, (12) A fracção 12. Reproduzido (adaptado) com permissão da Darville e Sokolowski 24. Direitos de autor 2013 pela American Chemical Society. Clique aqui para ver imagem ampliada.

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    Figura 5. GO componentes celulares perfil de IDs de proteína quando se realiza uma (A), primeiro e segundo digestão com tripsina após separação GELFrEE e (B) primeiro a digestão com LysC seguido por uma segunda digestão com tripsina após separação GELFrEE. Todas as categorias são contados de forma não exclusiva, quando a proteína tem mais de uma categoria para os componentes celulares. Clique aqui para ver imagem ampliada.

    Figura 6
    Figura 6. GO perfil de componentes celulares para todas as proteínas identificadas usando SCX, cera, ou separação GELFrEE. Quando uma proteína tinham mais do que uma categoria de componentes celulares, toda a sua categories foram contados nonexclusively. Clique aqui para ver imagem ampliada.

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    Discussion

    Os principais passos para maximizar a identificação de proteínas do epitélio sensorial da cóclea são: 1) uso de múltiplos endoproteinases para a digestão, 2) utilização de múltiplas técnicas de separação, e 3) a utilização de um espectrômetro de massa de alta resolução. A aplicação de enzimas múltiplas aumenta o número de péptidos e melhora a cobertura da sequência de proteína, portanto, melhorar o número de proteínas identificadas a partir do tecido da cóclea. Tripsina, a protease mais utilizada fornece clivagem eficiente e específica de proteínas, a gerar péptidos que são bons para a MS de ionização e fragmentação. No entanto, utilizando uma outra enzima antes de tripsina, tal como LysC, que também cliva no resíduo de lisina, fornece mais eficiente de clivagem do péptido. Observou-se que a cobertura da sequência das proteínas geradas a partir da digestão LysC / tripsina apresentaram um aumento na proteína de cobertura de sequência em relação à sequência da proteína de cobertura de tripsina / tripsina digest.

    ove_content "> A aplicação de separação multidimensional antes MS reduzida a complexidade elevada amostra coclear na abordagem proteómica espingarda. Isto permitiu a identificação de mais proteínas, incluindo proteínas de membrana, que são normalmente difíceis de identificar. Foi identificado um grande número de proteínas de membrana usando a abordagem de espingarda, em oposição à abordagem de baixo para cima. No entanto, a abordagem de baixo para cima utilizando GELFrEE permitido para a identificação de proteínas abundantes mais baixas. Isto deve-se ao isolamento de proteínas de maior abundantes, tais como Cochlin da cóclea, em indivíduo frações.

    Os dados de alta qualidade alcançados no presente protocolo por um espectrómetro de massa de alta resolução, tal como um LTQ-Orbitrap, melhora e aumenta o número de proteínas que podem ser identificadas na cóclea. O LTQ-Orbitrap oferece alta resolução, precisão de massa de alta e de alta sensibilidade para a análise de péptidos. Assim, a aplicação deste instrumento enables identificação de proteínas a partir de amostras biológicas complexas, tal como o epitélio sensorial da cóclea e aumenta a identificação de peptídeos de baixo abundantes. A utilização dessas abordagens experimentais combinados com a poderosa ferramenta da MS ajuda a aumentar significativamente o conjunto de dados de proteínas coclear, melhorando a oportunidade de identificar novos biomarcadores de proteínas envolvidas na audição e surdez.

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    Disclosures

    Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

    Acknowledgments

    Os autores agradecem ao Dr. Kent Seeley, diretor do Center for Drug Discovery e Inovação (CDDI) Proteômica Núcleo Facilidade na Universidade do Sul da Flórida para o uso desta facilidade. Este trabalho foi financiado pelo NIH / NIDCD R01 DC004295 a BHAS

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    8% Tris-acetate cartridge  Protein Discovery 42103
    Acetone Sigma-Aldrich 179124
    Acetonitrile Honeywell 015-1L
    AEBSF Calbiochem 101500
    Ammonium formate Fisher Scientific AC16861
    Aprotinin Calbiochem 616370
    ASB-14  Calbiochem 182750-5GM
    Bovine serum albumin BioRad 500-0112
    C18 column  New Objective A25112 75 μm x 10 cm 
    DC Protein Assay BioRad 500-0116 Microplate Assay Protocol
    EDTA Sigma-Aldrich E9884
    Endoproteinase Lys-C Sigma-Aldrich P3428
    FASP Protein Digestion Kit Protein Discovery 44250
    Formic acid  Fluka 94318
    GELFrEE Fractionation System Protein Discovery 42001 GELFrEE 8100
    Leupeptin Calbiochem 108975
    MacroSpin Column The Nest Group SMM SS18V Silica C18
    Microcystin Calbiochem 475815
    Pepstatin Sigma-Aldrich P5318
    Polysulfoethyl A Column The Nest Group 202SE0503
    Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771
    Sonic Dismembrator  Thermo Fisher 15-338-53 Model 100
    Trypsin Sigma-Aldrich T6567 Proteomics Grade

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    References

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    Bioquímica Edição 85 Cochlear cromatografia LC-MS/MS espectrometria de massa Proteômica epitélio sensorial
    Bottom-up e espingarda Proteômica para Identificar um Comprehensive Coclear Proteome
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    Darville, L. N. F., Sokolowski, B.… More

    Darville, L. N. F., Sokolowski, B. H. A. Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome. J. Vis. Exp. (85), e51186, doi:10.3791/51186 (2014).

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